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白蛋白/透明质酸纳米颗粒制备及递送顺铂效果

王太兵 李颖 贾卓翰 郭敏 胥伟军 钱军民 锁爱莉

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白蛋白/透明质酸纳米颗粒制备及递送顺铂效果

    作者简介: 王太兵(1995—),男,硕士研究生,主要从事医用高分子纳米材料研究。E-mail:wangbing1995@stu.xjtu.edu.cn.
    通讯作者: 钱军民, jmqian@mail.xjtu.edu.cn ; 锁爱莉, ailisuo@mail.xjtu.edu.cn
  • 中图分类号: TB34

Preparation of Albumin/Hyaluronic Acid Composite Nanoparticles for Cisplatin Delivery

    Corresponding author: QIAN Junmin, jmqian@mail.xjtu.edu.cn ;SUO Aili, ailisuo@mail.xjtu.edu.cn
  • CLC number: TB34

  • 摘要: 利用白蛋白模板法,以白蛋白、酰肼化透明质酸和醛基化透明质酸为原料,制备出了白蛋白/透明质酸(B-HA)纳米载体,其可通过配位作用装载顺铂(Cis)得到B-HA/Cis纳米药物。利用FT-IR光谱、1H-NMR谱、透射电子显微镜和电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)等手段表征了B-HA纳米载体的化学结构和B-HA/Cis纳米药物的理化性质。结果表明:该纳米载体装载顺铂后为近球形形貌,平均粒径约为150 nm,顺铂载药量可达10.8%;纳米药物具有还原性/酸性双重响应性药物释放行为。体外细胞实验表明,该纳米载体的细胞毒性可忽略,纳米药物对HepG2肝癌细胞有靶向作用,杀伤效果与游离态顺铂相当,杀伤癌细胞的机制是诱导凋亡。白蛋白/透明质酸纳米颗粒是综合性能优异的顺铂靶向递送载体,有望在体内呈现提高疗效、降低毒副作用的效果。
  • 图 1  在D2O中测得的HA(a)和AHA(b)的1H-NMR谱图

    Figure 1.  1H-NMR spectra of HA (a) and AHA (b) in D2O

    图 2  BSA、B-HA和HHA的FT-IR谱图

    Figure 2.  FT-IR spectra of BSA, B-HA and HHA

    图 3  纳米药物的平均粒径和Zeta电位(a)以及TEM照片(b)

    Figure 3.  Average size and zeta potential(a) and TEM image(b) of nanodrug

    图 4  纳米药物在肿瘤细胞模拟环境中释放顺铂的行为

    Figure 4.  Release behaviors of cisplatin from nanodrug in simulated tumor cellular environments

    图 5  FITC标记的B-HA纳米载体处理HepG2细胞的CLSM照片

    Figure 5.  CLSM images of HepG2 cells incubated with FITC-labeled B-HA nanocarriers

    图 6  B-HA纳米载体的体外细胞毒性(a)、纳米药物的IC50值(b)及纳米药物处理HepG2细胞的杀伤效果(c)

    Figure 6.  In vitro cytotoxicity of B-HA nanocarrier (a), IC50 of nanodrug (b) and killing effect of nanodrug on HepG2 cells (c)

    图 7  PBS(a)、纳米载体(b)、透明质酸+纳米药物(c)、纳米药物(d)和游离顺铂(e)处理HepG2细胞48 h后的凋亡/坏死情况

    Figure 7.  Apoptosis/necrosis of HepG2 cells treated with PBS (a), nanocarrier (b), HA + nanodrug (c), nanodrug (d) and free cisplatin (e) for 48 h

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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-18
  • 网络出版日期:  2021-04-21

白蛋白/透明质酸纳米颗粒制备及递送顺铂效果

    通讯作者: 钱军民, jmqian@mail.xjtu.edu.cn
    通讯作者: 锁爱莉, ailisuo@mail.xjtu.edu.cn
    作者简介: 王太兵(1995—),男,硕士研究生,主要从事医用高分子纳米材料研究。E-mail:wangbing1995@stu.xjtu.edu.cn
  • 1. 西安交通大学金属材料强度国家重点实验室,西安710049
  • 2. 西安交通大学第一附属医院肿瘤内科,西安 710061

摘要: 利用白蛋白模板法,以白蛋白、酰肼化透明质酸和醛基化透明质酸为原料,制备出了白蛋白/透明质酸(B-HA)纳米载体,其可通过配位作用装载顺铂(Cis)得到B-HA/Cis纳米药物。利用FT-IR光谱、1H-NMR谱、透射电子显微镜和电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)等手段表征了B-HA纳米载体的化学结构和B-HA/Cis纳米药物的理化性质。结果表明:该纳米载体装载顺铂后为近球形形貌,平均粒径约为150 nm,顺铂载药量可达10.8%;纳米药物具有还原性/酸性双重响应性药物释放行为。体外细胞实验表明,该纳米载体的细胞毒性可忽略,纳米药物对HepG2肝癌细胞有靶向作用,杀伤效果与游离态顺铂相当,杀伤癌细胞的机制是诱导凋亡。白蛋白/透明质酸纳米颗粒是综合性能优异的顺铂靶向递送载体,有望在体内呈现提高疗效、降低毒副作用的效果。

English Abstract

  • 癌症治疗是世界性难题,化疗是癌症治疗的基本手段。化疗药物顺铂(Cis)广泛应用于各种肿瘤的临床治疗,但其疗效受制于严重的毒副作用和耐药问题,如慢性神经毒性、急性肾毒性等[1, 2]。目前,开发多功能的纳米递送体系已成为增加药物在肿瘤中的积累和降低毒副作用的重要研究方向[3, 4]。然而,与疏水性的紫杉醇或阿霉素可载于纳米胶束中不同,水溶性的顺铂无法直接装载于纳米胶束中,需要对顺铂进行改性方能装载于纳米胶束中,但这会改变药物代谢动力学,影响疗效[5]。因此,迫切需要开发出能直接装载顺铂的新型纳米递送体系。

    透明质酸(HA)是生物相容性优异、无免疫原性、可生物降解的天然多糖,并且能识别、靶向高表达CD44受体或透明质酸结合蛋白1的肿瘤细胞,是综合性能优异的药物载体材料[6-8]。有研究表明,HA的羧基能与顺铂发生络合反应,形成大分子药物或纳米凝胶,有助于提高顺铂的抗肿瘤效果[9]。此外,通过静电作用和络合反应分别将疏水性的阿霉素和亲水性顺铂装载于HA上,可经自组装过程形成纳米药物,在提高乳腺癌治疗效果的同时可降低毒副作用[10, 11]。然而,利用顺铂-羧基络合方式装载顺铂,其装载过程费时,且顺铂装载量和释放过程不可控。

    本研究提出以白蛋白为模板,以酰肼化透明质酸(HHA)和醛基化透明质酸(AHA)为原料,经非溶剂化和原位交联反应,制成具有互穿网络结构的白蛋白/透明质酸(B-HA)纳米载体,B-HA再经顺铂-酰肼配位化学作用将顺铂装载于纳米载体上,得到B-HA/Cis纳米药物。对该纳米药物的理化性质和杀伤HepG2肝癌细胞的效果进行了系统研究。结果表明,B-HA纳米载体可高效装载顺铂,B-HA/Cis对肝癌细胞有靶向杀伤作用。

    • 透明质酸(HA:Mw≈8×103),生物试剂,山东华熙福瑞达生物医药有限公司;牛血清白蛋白(BSA):生物试剂,Sigma-Aldrich公司;顺铂(Cis):纯度98%,昆明贵研药业有限公司;无水乙醇:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;肝癌(HepG2)细胞:西安交通大学医学院提供;胎牛血清(FBS):生物试剂,碧云天生物技术有限公司;高糖(DMEM)培养基:生物试剂,上海麦克林生化科技有限公司;多聚甲醛:生物试剂,w=4%,北京鼎国昌盛生物技术有限公司;MTT试剂盒:碧云天生物技术有限公司;Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒:上海七海复泰生物科技有限公司。

    • 采用瑞士BRUKER公司Bruker 400M型核磁共振波谱仪测试AHA和HA的核磁共振氢谱(1H-NMR),1H-NMR的分辨率小于0.45 Hz,灵敏度大于900;采用美国Nicolet公司AVATAR 360型红外光谱仪(FT-IR)分析纳米载体的特征吸收峰,红外光谱的分辨率为4 cm−1,记录范围从400 cm-1到4 000 cm−1;采用美国PerkinElmer公司NexION 350D型电感耦合等离子体-质谱仪(ICP-MS)检测铂元素含量,计算载药率和载药效率;采用英国Malven公司Nano-ZS90型激光粒度仪/Zeta电位仪测定纳米颗粒的粒径和Zeta电位,动态光散射法(DLS)测试条件为散射角90°和温度25 ℃;采用日本NEC公司JEM-200CX 型透射电子显微镜(TEM)观察纳米药物形貌;采用德国徕卡显微系统TCS SP8型共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞对纳米药物的摄取并拍照;采用美国Agilent公司ACEA NovoCyte型流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

    • HHA由课题组合成,具体见文献[12]。AHA用高碘酸钠氧化法合成,根据文献[13]进行。纳米载体制备过程如下:将100 mg白蛋白和50 mg HHA溶于pH=9的12.5 mL水中,然后依次滴加50 mL无水乙醇(速率为1 mL/min)和3 mL质量浓度为20 mg/mL的AHA溶液,经离心、洗涤和冷冻干燥收集纳米载体。为装载顺铂,在超声作用下将40 mg纳米载体分散于10 mL水中,然后加入10 mL质量浓度为2 mg/mL的顺铂水溶液,于37 ℃反应12 h后进行冷冻干燥,得到所需纳米药物。

    • 配制20 mL质量浓度为1 mg/mL纳米药物悬液,均分装入4个透析袋(截留分子量为3 000)中,分别浸没在200 mL的磷酸盐缓冲液(PBS)透析液中,置于摇床上振荡。PBS透析液的pH为5.5或7.4,含有或不含浓度为10 mmol/L的谷胱甘肽。在设定时间节点,取出2 mL透析液,并补充2 mL新鲜的透析液。取出透析液中的铂含量用ICP-MS检测,计算出相应的药物释放率。

    • 将1×105个HepG2细胞接种在激光共聚焦皿中培养24 h,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的纳米载体(用量为20 μg/mL)共培养4、12 h或24 h后,用移液枪吸弃培养基,加入适量PBS溶液清洗3次;将细胞经w=4%的多聚甲醛溶液固定30 min,清洗干净后再用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染液染色10 min,清洗后使用CLSM观察细胞内荧光。

    • 通过MTT法测定了纳米载体、游离顺铂和纳米药物对HepG2细胞的毒性:将HepG2细胞以每孔1×104个的浓度接种在96孔板中,培养24 h后分别用不同浓度梯度的纳米载体、游离顺铂和纳米药物孵育48 h。配制5 mg/mL的MTT溶液,每个孔中加入20 μL MTT,将96孔板继续置于培养箱中培养4 h。随后将培养板取出,使用移液器将每个孔中的培养基吸弃,向每个孔中加入150 μL二甲基亚砜(DMSO),在恒温摇床(140 r/min)中避光振荡10 min。最后将96孔板置于酶标仪上测定490 nm处的吸光度,计算出细胞存活率。

      采用流式细胞术研究纳米药物对肿瘤细胞凋亡的影响:将HepG2细胞以每孔5×105个的浓度接种到6孔板中,培养24 h后加入游离顺铂、B-HA纳米颗粒、去靶向B-HA/cis纳米药物、靶向B-HA/cis纳米药物,再孵育48 h后进行消化和离心分离,最后将收集的细胞利用复合缓冲液制成悬浮液,经Annexin V-EGFP/PI染色后进行流式细胞术,检测细胞凋亡情况。

    • 利用经典的高碘酸钠氧化法将HA制成氧化度为40%的AHA,HA醛基化前后的1H-NMR谱见图1。与图1(a)中HA的1H-NMR谱图相比,AHA的1H-NMR谱图(图1(b))不仅具有透明质酸中糖环结构上质子的特征峰(3.30~4.40),还在4.8~5.0处出现了醛基质子的特征峰,这证实了AHA的成功合成[14]

      图  1  在D2O中测得的HA(a)和AHA(b)的1H-NMR谱图

      Figure 1.  1H-NMR spectra of HA (a) and AHA (b) in D2O

    • 图2给出了BSA、HHA和B-HA纳米载体的FT-IR谱图。在纳米载体的FT-IR谱图中,1 640、1 540 cm−1处的吸收峰分别归属于BSA中肽键的C=O伸缩振动和N―H弯曲振动[15],其中1 540 cm−1处的吸收峰覆盖了HHA中酰肼基团的特征吸收峰(1 565 cm−1);以3 416 cm−1为中心的宽吸收峰归属于O―H和N―H的伸缩振动。这些结果证实,B-HA纳米载体是由BSA和HHA复合而成的。

      图  2  BSA、B-HA和HHA的FT-IR谱图

      Figure 2.  FT-IR spectra of BSA, B-HA and HHA

    • 在制备B-HA纳米载体的过程中,BSA和HHA的浓度,以及它们的质量比是决定B-HA纳米载体粒径和Zeta电位的关键因素。考虑到粒径是纳米载体经肿瘤组织高效渗透长滞留(EPR)效应实现被动靶向的决定性因素,确定出了制备B-HA纳米载体的最优配方和工艺条件。在此条件下获得的纳米载体的流体动力学尺寸和Zeta电位分别为145 nm和−23.0 mV,在装载顺铂后B-HA/Cis的平均粒径略微增加至150 nm,Zeta电位升高至−15.1 mV,见图3(a)。该结果表明,纳米药物的流体动力学尺寸仍处于易经肿瘤组织EPR效应积累于肿瘤的粒径范围(小于200 nm)内[16, 17],而纳米药物荷负电则可避免其被内质网系统清除,有利于经长循环靶向积累于肿瘤中[18]。由图3(b)中的TEM照片可以看出,B-HA/Cis纳米药物呈近圆形形貌,其粒径均一性小于DLS的结果。造成这种差异的原因为,纳米药物中透明质酸对光的散射作用极弱,难以在DLS的结果中得到反映,DLS结果主要为粒径均一的球形BSA颗粒的粒径,故粒径分布较窄;而在以TEM观察样品时,能看到纳米药物颗粒的全貌(含HA和BSA),粒径均一性有所降低。

      图  3  纳米药物的平均粒径和Zeta电位(a)以及TEM照片(b)

      Figure 3.  Average size and zeta potential(a) and TEM image(b) of nanodrug

    • 本文制得纳米药物的载药率和载药效率分别为10.8%和90.0%,显著高于文献中的相应数据[19],这主要归因于采用的新型铂-酰肼配位方法。为探究纳米药物在肿瘤微环境中释放顺铂的行为,利用PBS模拟肿瘤细胞内微环境中的酸性(pH=5.5)和还原性(谷胱甘肽(GSH)浓度为10 mmol/L),顺铂释放行为见图4。由图4可以看出,在中性溶液(pH=7.4)中,72 h内顺铂释放率不到27.6%。相比之下,酸性或还原性环境显著提高了顺铂的释放速率,72 h的释放率分别达到47.3%和56.4%;而在酸性/还原性环境中,顺铂释放最快,释放率达到76.0%。结果表明,B-HA/Cis纳米药物可以响应肿瘤细胞内微环境实现药物释放,从而提高疗效。纳米药物具有刺激响应性药物释放行为的主要原因为,顺铂与载体之间是通过对酸敏感的配位键和对还原性敏感的二硫键连接的,可分别响应酸性和还原性断裂,从而释放顺铂[20, 21]。因此,B-HA/Cis纳米药物具有酸性/还原性双重敏感性释放顺铂的特性。

      图  4  纳米药物在肿瘤细胞模拟环境中释放顺铂的行为

      Figure 4.  Release behaviors of cisplatin from nanodrug in simulated tumor cellular environments

    • 为观察HepG2细胞对B-HA纳米载体的摄取行为,利用异硫氰酸荧光素(FITC)对纳米载体进行了绿色荧光标记,用其处理HepG2细胞,细胞摄取B-HA纳米载体的效果见图5。由图5可以看出,随培养时间延长,细胞中绿色荧光强度增加,表明细胞摄取了更多的B-HA纳米载体,其主要原因是B-HA纳米载体上的透明质酸对HepG2细胞过表达的CD44受体有特异性结合功能[22]。可见,B-HA/Cis纳米药物在肝癌靶向治疗中具有开发潜力。

      图  5  FITC标记的B-HA纳米载体处理HepG2细胞的CLSM照片

      Figure 5.  CLSM images of HepG2 cells incubated with FITC-labeled B-HA nanocarriers

    • 利用MTT法评价了B-HA纳米载体的细胞毒性和B-HA/Cis纳米药物杀伤HepG2细胞的能力,结果如图6所示。由图6(a)可以看出,随纳米载体浓度增加,细胞存活率有所下降,但即使纳米载体质量浓度高达160 μg/mL时细胞存活率仍高于80%,这表明纳米载体的细胞毒性微乎其微。纳米载体良好的细胞相容性主要归因于原料BSA和HA的生物相容性优异。从图6(b)可以看出,B-HA/Cis纳米药物对HepG2细胞的杀伤效果呈现显著的浓度依赖性,其半抑制浓度(IC50)高于游离顺铂的IC50;在顺铂含量相同时,纳米药物杀伤HepG2细胞的效果略低于游离顺铂,这是因为游离顺铂可经扩散直接进入细胞内发挥作用,而纳米药物在进入细胞后需要一定时间释放顺铂,造成其杀伤效果滞后于游离顺铂。为验证这一猜测,评价了顺铂或纳米药物与HepG2细胞共孵育不同时间后的杀伤效果,结果见图6(c)。可以看出,两种用药方式对HepG2细胞的杀伤效果均随孵育时间的延长而增强。值得注意的是,在孵育24 h和48 h时,纳米药物的杀伤效果略低于游离顺铂,而72 h时纳米药物的杀伤效果则优于游离顺铂。上述结果证实了B-HA/Cis纳米药物在细胞内释放顺铂需要一定时间的猜测。

      图  6  B-HA纳米载体的体外细胞毒性(a)、纳米药物的IC50值(b)及纳米药物处理HepG2细胞的杀伤效果(c)

      Figure 6.  In vitro cytotoxicity of B-HA nanocarrier (a), IC50 of nanodrug (b) and killing effect of nanodrug on HepG2 cells (c)

      为揭示纳米药物杀伤HepG2细胞的作用机制,利用流式细胞术评价了纳米药物(ρB-HA/Cis=24 μg/mL,ρCis=2.6 μg/mL)处理HepG2细胞48 h后的凋亡/坏死情况,结果如图7所示。由图7可知,PBS和B-HA纳米载体处理HepG2细胞时,未受影响的细胞占比分别为85.5%和85.3%(图7(a)(b)),两者几乎无差别,进一步证实了B-HA纳米载体优异的细胞相容性。B-HA/Cis纳米药物处理的细胞发生凋亡和坏死的比例为76.7%(图7(c)),然而若在施用纳米药物前用ρ=1 mg/mL的HA预处理细胞以实现去靶向目的,则细胞凋亡/坏死比例降为63.3%(图7(d)),这表明游离HA可与纳米药物竞争性黏附HepG2细胞,降低细胞对纳米药物的摄取,证实纳米药物对HepG2细胞有主动靶向功能。另外,游离顺铂处理的细胞发生凋亡和坏死的比例为83%(图7(e)),高于纳米药物处理的细胞,表明纳米药物杀伤HepG2细胞的效果具有一定滞后性,与前述MTT结果一致。

      图  7  PBS(a)、纳米载体(b)、透明质酸+纳米药物(c)、纳米药物(d)和游离顺铂(e)处理HepG2细胞48 h后的凋亡/坏死情况

      Figure 7.  Apoptosis/necrosis of HepG2 cells treated with PBS (a), nanocarrier (b), HA + nanodrug (c), nanodrug (d) and free cisplatin (e) for 48 h

    • (1)将白蛋白的非溶剂化自组装现象和新型顺铂-酰肼配位化学结合,制备了白蛋白/透明质酸纳米载体,其装载顺铂的载药量和载药效率分别为10.8%和90%。

      (2)B-HA/Cis的平均粒径约为150 nm,形貌为近球形,并具有响应肿瘤细胞内微环境中的酸性和还原性释放顺铂的特性。

      (3)B-HA/Cis纳米药物载体可主动靶向HepG2肝癌细胞,其体外杀伤HepG2的细胞效果与游离顺铂相当;并且纳米载体具有良好的生物相容性。

参考文献 (22)

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