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纤维蛋白在聚(2-甲基-2-噁唑啉)/聚丙烯酸混合聚合物刷上的吸附-脱附行为研究

胡飞 朱良宇 王雨晨 何康 ATIFMuhammad 王延梅

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纤维蛋白在聚(2-甲基-2-噁唑啉)/聚丙烯酸混合聚合物刷上的吸附-脱附行为研究

    作者简介: 胡 飞(1996.7—),男,安徽宣城人,硕士,主要研究方向为抗污涂层。E-mail:hufei123@mail.ustc.edu.cn.
    通讯作者: 王延梅, wangyanm@ustc.edu.cn
  • 中图分类号: O647

Study on Adsorption and Desorption Behavior of Fibrinogen on Poly (2-methyl-2-oxazoline)/Poly(acrylic acid) Mixed Brushes

    Corresponding author: WANG Yanmei, wangyanm@ustc.edu.cn
  • CLC number: O647

  • 摘要: 以聚多巴胺(PDA)为黏结剂,在硅、玻璃和金表面制备了由具有抗蛋白质吸附功能的聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOXA)和具有刺激响应性的聚丙烯酸(PAA)组成的混合聚合物刷。通过X-射线光电子能谱(XPS)、可变角光谱椭偏仪(VASE)对其进行了表征,并使用水接触角(WCA)研究了聚合物刷表面的亲疏水性。选取pH 9、I = 0.01 mol/L作为纤维蛋白吸附条件,pH 9、I = 0.15 mol/L为脱附条件,用荧光显微镜和表面等离子共振(SPR)分别定性和定量地研究了混合聚合物刷对纤维蛋白的吸附-脱附行为。结果表明,当环境条件由pH 9、I = 0.01 mol/L向pH 9、I = 0.15 mol/L转变时,混合聚合物刷表面会从相对疏水状态转变为亲水状态;增加PMOXA的聚合度会减少混合聚合物刷对蛋白质的吸附量,同时也会明显改善混合聚合物刷对蛋白质的脱附率;聚合度60的PMOXA和聚合度90的PAA以质量比3∶2顺序接枝制备的混合聚合物刷实现了对纤维蛋白83.5%的脱附率。
  • 图 1  PMOXA/PAA混合聚合物刷制备示意图

    Figure 1.  Schematic illustration for the preparation of PMOXA/PAA mixed polymer brushes

    图 2  (a)硅片经修饰前后的XPS谱图和(b, c, d, e)修饰硅片的C1s高分辨XPS谱图

    Figure 2.  (a) XPS patterns of bare and modified silicon wafers and (b, c, d, e) high-resolution XPS spectra of C1s peaks of modified silicon wafers

    图 3  裸硅片和修饰硅片的WCA值

    Figure 3.  WCA values of bare and modified silicon wafers

    图 4  (a)裸玻璃片和修饰玻璃片吸附FITC-Fib的荧光图像 (b)相应荧光照片的相对荧光强度

    Figure 4.  (a) Fluorescence images of FITC-Fib adsorbed on bare glass and modified glass (b) Relative fluorescence intensities of above images

    图 5  纤维蛋白在裸金片和不同聚合度PMOXA涂层金片上吸附的SPR图

    Figure 5.  SPR sensorgram of fibrinogen adsorption on bare and PMOXA-coated gold surface with different degrees of polymerization

    图 6  纤维蛋白在PMOXA(60)-PAA混合聚合物刷表面吸附-脱附的SPR图

    Figure 6.  SPR sensorgram of fibrinogen adsorption and desorption on PMOXA(60)-PAA mixed polymer brush surface

    图 7  混合聚合物刷对纤维蛋白吸附和脱附的可能机理

    Figure 7.  Possible mechanism of adsorption and desorption of fibrinogen on mixed brushes

    表 1  硅片经修饰前后表面元素的原子百分含量及聚合物刷的相应厚度和接枝密度/接枝链间距

    Table 1.  Atomic percentage of elements on the bare and modified silicon surfaces, and the corresponding thickness and grafting density/grafting chain spacing of the polymer brushes

    SamplesElement mole percent/(atom %)(N/O)/%d/nmσ/(nm−2a$ l $/nmb
    C(1s)N(1s)Si(2s)S(2p)O(1s)
    Bare silicon16.420.5850.67/32.331.79///
    PDA72.957.292.42/17.3442.0417.0±1.4//
    PMOXA(20)71.619.882.56/15.9561.942.2±0.30.771.14
    PMOXA(40)69.9211.330.69/18.0662.732.5±0.30.441.51
    PMOXA(60)69.7411.511.06/17.6965.073.2±0.50.381.62
    PAA72.086.431.391.11933.843.7±0.50.341.71
    PMOXA(20)-PAA67.76.783.010.6421.8731.004.5±1.20.212.18
    PMOXA(40)-PAA69.847.392.970.5819.2238.453.7±0.20.113.02
    PMOXA(60)-PAA69.118.952.490.5118.9447.253.5±0.40.035.77
    a The grafting density ($ \sigma $) of polymer $\sigma = d\rho {N_A}/{M_{\rm{n}}}$, where $ d $ is the ellipsometric thickness, $ \rho $ is the density of polymer (about 1.0 g/cm3), $ {N}_{A} $ is the Avogadro’s number, and ${M_{\rm{n}}}$ is the molecular weight of the grafted polymer calculated according to results of 1H-NMR. The grafting density of PMOXA in mixed brush should be the same as that in homopolymer brush. The grafting density of PAA chains in mixed brush was assumed that dmix= dm+ dA for simplicity, where dmix is the thickness of mixed brush, dmix the thickness of pure PMOXA brush, and dA is the thickness of PAA in the mixed brush.
    bThe grafting chain spacing ($ l $) of polymer $ l={\sigma }^{-0.5} $.
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    表 2  根据SPR数据计算纤维蛋白吸附量、脱附后剩余量和脱附率

    Table 2.  Mass of fibrinogen adsorption, remaining mass after desorption, and resultant desorption percentage based on SPR data

    SamplesΔmadsorption/(ng·cm−2Δmafter desorption/(ng·cm−2Desorption percentage/%
    Bare gold681.9561.417.7
    PDA780.7770.01.3
    PAA1318.9735.044.3
    PMOXA(20)-PAA1238.8413.566.6
    PMOXA(40)-PAA978.0218.477.7
    PMOXA(60)-PAA806.8132.983.5
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-19
  • 网络出版日期:  2021-03-04

纤维蛋白在聚(2-甲基-2-噁唑啉)/聚丙烯酸混合聚合物刷上的吸附-脱附行为研究

    通讯作者: 王延梅, wangyanm@ustc.edu.cn
    作者简介: 胡 飞(1996.7—),男,安徽宣城人,硕士,主要研究方向为抗污涂层。E-mail:hufei123@mail.ustc.edu.cn
  • 中国科学技术大学化学与材料科学学院,合肥 230026

摘要: 以聚多巴胺(PDA)为黏结剂,在硅、玻璃和金表面制备了由具有抗蛋白质吸附功能的聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOXA)和具有刺激响应性的聚丙烯酸(PAA)组成的混合聚合物刷。通过X-射线光电子能谱(XPS)、可变角光谱椭偏仪(VASE)对其进行了表征,并使用水接触角(WCA)研究了聚合物刷表面的亲疏水性。选取pH 9、I = 0.01 mol/L作为纤维蛋白吸附条件,pH 9、I = 0.15 mol/L为脱附条件,用荧光显微镜和表面等离子共振(SPR)分别定性和定量地研究了混合聚合物刷对纤维蛋白的吸附-脱附行为。结果表明,当环境条件由pH 9、I = 0.01 mol/L向pH 9、I = 0.15 mol/L转变时,混合聚合物刷表面会从相对疏水状态转变为亲水状态;增加PMOXA的聚合度会减少混合聚合物刷对蛋白质的吸附量,同时也会明显改善混合聚合物刷对蛋白质的脱附率;聚合度60的PMOXA和聚合度90的PAA以质量比3∶2顺序接枝制备的混合聚合物刷实现了对纤维蛋白83.5%的脱附率。

English Abstract

  • 纤维蛋白是肝细胞在肝脏合成的一种高度丰富的血浆糖蛋白,它在凝血、血小板活化、炎症反应和白细胞结合中起着重要作用。纤维蛋白的等电点约为5.8,分子量约为3.4×105[1, 2],具有棒状结构(47 nm×5 nm×5 nm)[3, 4]。纤维蛋白是一种黏附性极强的蛋白,很容易在硅、金等材料表面发生吸附[5]。目前纤维蛋白在材料表面的吸附主要有两种机理,即随机吸附机理和侧向吸附机理[6, 7]。值得注意的是,纤维蛋白分子上存在不均匀电荷分布,它的末端侧臂在pH 3 ~ 10的范围内带正电荷。因此当环境的pH高于纤维蛋白等电点的时候,它的末端侧臂与带负电荷的硅、金等材料的表面会产生强烈的吸附,从而产生如文献报道中蛋白质在等电点上发生“wrong side”吸附的现象[8, 9]。纤维蛋白单分子层在基底或各种合成材料上的吸附会诱导血小板黏附,从而影响材料表面的功能[10],通过在材料表面接枝具有刺激响应功能的二元混合聚合物刷可以实现对纤维蛋白的选择性吸附和释放行为。

    具有刺激响应功能的二元混合聚合物刷通常是由两种不同功能的聚合物在材料表面形成的聚合物刷,其中一种聚合物具有抗蛋白质吸附的功能,另一种具有刺激响应功能[11, 12]。聚丙烯酸(PAA)是常见的刺激响应性聚合物,当PAA接枝到材料表面形成聚合物刷后,PAA链的构象会受溶液中pH和离子强度(I)的影响。当环境pH大于PAA的酸度系数时,羧基会发生解离,PAA链带负电,在水溶液中呈伸展状态。在保持环境pH不变的条件下增大离子强度,静电屏蔽效应会导致PAA链的塌缩。因此,将PAA和具有抗蛋白质吸附功能的聚合物接枝到基底表面形成的混合聚合物刷,在研究蛋白质的吸附-脱附行为中有着极其重要的作用。Bratek-Skicki等[13]制备了由PAA和具有抗蛋白质吸附功能的聚乙二醇(PEO)组成的混合聚合物刷,研究表明纤维蛋白可分别在pH = 9、I = 10-3 mol/L和pH = 9、I = 10-2 mol/L的条件下产生吸附,在pH 9、I = 0.15 mol/L的条件下能够脱附,而且纤维蛋白的吸附量随PEO的摩尔质量增大而减少。PEO是通用的一种亲水性抗污聚合物[14-16],在材料表面涂覆上PEO可以一定程度地阻抗纤维蛋白的吸附[17],并且PEO的分子量越大,PEO链变形能力越强,对纤维蛋白的阻抗能力越强[18]。然而,PEO在生物体内长期使用时会发生氧化降解[19, 20]。聚(2-烷基-2-噁唑啉)(PAOx)是一类应用广泛的类肽聚合物,可通过2-噁唑啉单体的活性阳离子开环聚合(CROP)合成,得到的聚合物具有分子量可控、分子量分布窄的特点,同时聚合物的末端或侧链易于功能化[21, 22]。相对于PEO,PAOx具有更良好的亲水性、生物相容性和在氧化性介质中的高度稳定性[23-25],因此这类聚合物在抗污领域受到了广泛关注。Pan等[26, 27]采用聚多巴胺(PDA)作为黏结剂,通过末端氨基化聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOXA-NH2)和末端巯基化PAA(PAA-SH)在各种基材(包括玻璃、硅和金)上的顺序接枝,制备了PMOXA/PAA混合聚合物刷。通过控制PAA的聚合度和接枝密度,改变溶液的pH和I,实现了对牛血清蛋白和溶菌酶87%以上的脱附率。

    本文研究了纤维蛋白在PMOXA/PAA混合聚合物刷上的吸附-脱附行为。首先合成聚合度分别为20、40和60的PMOXA-NH2和聚合度90的PAA-SH,以PDA为黏结剂在硅片等基底上制备了一系列的均聚物刷和混合聚合物刷,通过X-射线光电子能谱(XPS)、可变角光谱椭偏仪(VASE)对其进行了表征,并使用水接触角(WCA)研究了聚合物刷表面的亲疏水性。然后,选取pH = 9、I = 0.01 mol/L作为纤维蛋白吸附条件,pH = 9、I = 0.15 mol/L为脱附条件,用荧光显微镜和表面等离子体共振(SPR)分别定性和定量地研究了混合聚合物刷对纤维蛋白的吸附-脱附行为。

    本工作丰富了刺激响应性涂层的生物应用范围,在生物传感器的设计、药物输送、蛋白质吸附-脱附等生物应用中具有广阔的发展前景。

    • 丙烯酸(AA)和二甲基甲酰胺(DMF):分析纯,国药集团化学试剂有限公司,通过减压蒸馏提纯;2-甲基-2-噁唑啉(MOXA):分析纯,Sigma-Aldrich化学品有限公司,用氢化钙干燥后蒸馏提纯;偶氮二异丁腈(AIBN):分析纯,天津光复精细化工研究所,通过乙醇重结晶提纯;盐酸多巴胺、三氟甲磺酸甲酯(MeOTf):分析纯,Sigma-Aldrich化学品有限公司;水合肼、邻苯二甲酰亚胺钾:分析纯,阿拉丁化学试剂(上海)有限公司;三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris):工业纯,国药集团化学试剂有限公司;乙醇胺、乙腈、三氯甲烷、乙醚、十二烷基三硫代碳酸酯:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;异硫氰酸荧光素(FITC)、纤维蛋白:生物试剂纯度,Sigma-Aldrich化学品有限公司,纤维蛋白等电点约为5.8,Mr约为3.4×105;溶液的pH和I通过盐酸(1 mol/L)、氢氧化钠溶液(1 mol/L)和氯化钠溶液调节;实验用水为去离子水。

    • X-射线光电子能谱(XPS)仪:英国VG公司ESCALAB MK II 型,激发源为Al(Kα)射线(能量1 486.6 eV),光电子的起始角为90°,光斑尺寸为500 μm;可变角光谱椭偏仪(VASE):美国J. A. Woollam公司M-2000 型,光谱范围为370 ~ 1 000 nm,入射角度为65°和75°,利用Complete Easy 4.81软件进行拟合,基于广义柯西层模型(A = 1.45,B = 0.01,C = 0)得到涂层厚度,每组设置三个平行样;接触角(CA)测量仪:美国KINO公司SL200KS型,硅片表面的静态水接触角所用水滴为去离子水,体积为2 μL,样品测量前在不同pH和I的水溶液中浸泡0.5 h,并立即用氮气干燥,每组设置3个平行样;光学显微镜:日本Olympus公司Olympus BX81型,配备卤素灯、U-MNG2过滤器(λexit = 470 ~ 490 nm,λemit > 510 nm)和DP72摄像机;表面等离子体共振(SPR)仪:美国GE Healthcare公司BioScience T200型,实时研究蛋白质吸附和脱附行为,通过RU值的变化(ΔRU)来定量蛋白质的吸附量和脱附量,10 RU相当于芯片表面上蛋白质质量浓度改变约1.0 ng/cm2

    • 以MeOTf为引发剂引发MOXA的阳离子开环聚合(CROP)反应(引发剂和单体的物质的量之比分别为1∶23,1∶43,1∶65),加入邻苯二甲酰亚胺钾封端,再加入水合肼,制得PMOXA-NH2。通过氢的核磁共振谱(1H-NMR)得到 PMOXA 的聚合度分别为20、40和60(对应的相对分子质量分别为1 731、3 431和5 131),理论链长[27]分别为7.24、14.49 nm和21.73 nm。

      以AIBN为引发剂、十二烷基三硫代碳酸酯为链转移剂、AA为单体(引发剂和单体的物质的量之比为1∶110),通过RAFT聚合合成PAA,再加入乙醇胺制得PAA-SH。通过1H-NMR得到 PAA 的聚合度为90(对应的相对分子质量为6 600),理论链长[27]为25.12 nm。

    • 混合聚合物刷的制备过程如图1所示。将基底(玻璃片、硅片和金片)相继在丙酮、乙醇、水中超声清洗20 min,氮气吹干后浸入Piranha溶液(体积比为7∶3的浓硫酸和双氧水混合物)于50 °C下浸泡12 h,然后用乙醇和水冲洗,氮气吹干。将清洗后的基底浸入多巴胺的tris-HCl溶液(2 mg/mL,pH = 8.5)中,于室温下振荡一定时间(硅片和玻璃片为4 h,金片为3 h)后,用去离子水冲洗30 s,氮气吹干。由于PMOXA-NH2的氨基和PAA-SH的羧基会发生反应,因此通过顺序接枝的方法制备混合聚合物刷。先将涂有PDA的基底浸入PMOXA-NH2的tris-HCl溶液(3 mg/mL,pH = 8.5)中,室温下反应12 h,用去离子水冲洗30 s,氮气吹干。再浸入PAA-SH的tris-HCl溶液(2 mg/mL,pH = 8.5)中于50 °C反应24 h,用乙醇和去离子水冲洗1 min,氮气吹干。将涂有PDA的基底在PMOXA-NH2 的tris-HCl溶液(3 mg/mL, pH = 8.5)或PAA-SH的tris-HCl溶液(2 mg/mL,pH = 8.5)中分别浸泡12 h和24 h,制备纯PMOXA或PAA刷作为对照组。在PDA涂层表面制备的混合聚合物刷记为PMOXA(a)-PAA,在PDA涂层表面制备的纯PMOXA或PAA刷记为PMOXA(a)或PAA,其中a表示聚合物PMOXA-NH2的聚合度。

      图  1  PMOXA/PAA混合聚合物刷制备示意图

      Figure 1.  Schematic illustration for the preparation of PMOXA/PAA mixed polymer brushes

    • 取10 mg纤维蛋白和1 mg FITC于离心管中,加9.5 mL交联液(0.046 mol/L NaHCO3、0.004 mol/L Na2CO3,pH = 9)和0.5 mL DMSO,在黑暗中振荡1 h溶解均匀,然后于4 °C反应4 h,冷冻离心除去未结合的FITC,于−18 °C冷冻保存。

    • 将裸玻璃片和聚合物修饰后的玻璃片在室温和黑暗条件下浸泡在FITC-Fib溶液(1.0 mg/mL,pH = 9、I = 0.01 mol/L)中2 h,取出后用pH = 9、I = 0.01 mol/L的水溶液洗涤3次。随后,将上述样品在pH = 9、I = 0.15 mol/L的水溶液中浸泡1.5 h,取出后用相同溶液洗涤3次,氮气干燥。通过Olympus BX81型光学显微镜拍摄荧光图片,用Image J软件测量荧光强度。每组设置3个平行样。

    • 将聚合物修饰前后的金片安装在SPR样品架上,用pH = 9、I = 0.01 mol/L的水溶液初始化2次。再用pH = 9、I = 0.01 mol/L的水溶液冲洗样品800 s以获得基线信号,将纤维蛋白溶液(0.1 mg/mL,pH = 9、I = 0.01 mol/L)通过金片表面900 s,使蛋白质在金片表面吸附。随后通过3个连续步骤进行清洗:首先,用pH = 9、I = 0.01 mol/L的水溶液通过样品表面600 s,除去表面吸附不牢固的蛋白质;然后,用pH = 9、I = 0.15 mol/L的水溶液通过样品表面600 s,进行蛋白质的脱附;最后,用pH = 9、I = 0.01 mol/L的水溶液冲洗样品表面600 s。

    • 通过XPS研究了修饰前后硅片表面的化学组成,结果如图2表1所示。裸硅片表面有很强的Si和O信号,并且由于样品制备过程中存在不可避免的污染,存在较少的C和N信号。裸硅片经PDA修饰后,C和N的信号峰强度明显增强,Si和O的信号峰强度明显降低,N/O值增大,C1s峰主要包含C―N/C―O(286 eV)、C―C/C―H(284.8 eV)2个峰,同时包含微弱的C=O(288.05 eV)峰,该峰与PDA氧化重排的过程有关。当PMOXA涂覆到PDA涂层表面后,N信号进一步增强,N/O值增大,C1s峰包含C―N/C―O(286 eV)、C―C/C―H(284.8 eV)和N―C=O(288.05 eV)3个峰。当PAA涂覆到PDA涂层表面后,166.4 eV处出现了明显的S信号(图1(a)),与此同时,C1s峰包含COOH(288.4 eV)峰,N/O值相对于PDA涂层有所减小。对于混合聚合物刷,均可以观察到S信号,并且混合聚合物刷中的PMOXA聚合度越大,对应涂层的S含量越低,N/O值越大,混合聚合物刷的C1s峰同时包含N―C=O峰和COOH峰,表明同时存在PMOXA和PAA。这些结果表明在PDA基底上成功制备了聚合物刷。

      图  2  (a)硅片经修饰前后的XPS谱图和(b, c, d, e)修饰硅片的C1s高分辨XPS谱图

      Figure 2.  (a) XPS patterns of bare and modified silicon wafers and (b, c, d, e) high-resolution XPS spectra of C1s peaks of modified silicon wafers

      SamplesElement mole percent/(atom %)(N/O)/%d/nmσ/(nm−2a$ l $/nmb
      C(1s)N(1s)Si(2s)S(2p)O(1s)
      Bare silicon16.420.5850.67/32.331.79///
      PDA72.957.292.42/17.3442.0417.0±1.4//
      PMOXA(20)71.619.882.56/15.9561.942.2±0.30.771.14
      PMOXA(40)69.9211.330.69/18.0662.732.5±0.30.441.51
      PMOXA(60)69.7411.511.06/17.6965.073.2±0.50.381.62
      PAA72.086.431.391.11933.843.7±0.50.341.71
      PMOXA(20)-PAA67.76.783.010.6421.8731.004.5±1.20.212.18
      PMOXA(40)-PAA69.847.392.970.5819.2238.453.7±0.20.113.02
      PMOXA(60)-PAA69.118.952.490.5118.9447.253.5±0.40.035.77
      a The grafting density ($ \sigma $) of polymer $\sigma = d\rho {N_A}/{M_{\rm{n}}}$, where $ d $ is the ellipsometric thickness, $ \rho $ is the density of polymer (about 1.0 g/cm3), $ {N}_{A} $ is the Avogadro’s number, and ${M_{\rm{n}}}$ is the molecular weight of the grafted polymer calculated according to results of 1H-NMR. The grafting density of PMOXA in mixed brush should be the same as that in homopolymer brush. The grafting density of PAA chains in mixed brush was assumed that dmix= dm+ dA for simplicity, where dmix is the thickness of mixed brush, dmix the thickness of pure PMOXA brush, and dA is the thickness of PAA in the mixed brush.
      bThe grafting chain spacing ($ l $) of polymer $ l={\sigma }^{-0.5} $.

      表 1  硅片经修饰前后表面元素的原子百分含量及聚合物刷的相应厚度和接枝密度/接枝链间距

      Table 1.  Atomic percentage of elements on the bare and modified silicon surfaces, and the corresponding thickness and grafting density/grafting chain spacing of the polymer brushes

      表1同时给出了涂层厚度(d)和相应涂层聚合物的接枝密度(σ)和链间距(l)。在室温下振荡4 h后,在硅片上得到了厚度为17 nm的致密PDA涂层。在PDA表面接枝PMOXA后,涂层的厚度随PMOXA聚合度的增加而增加,PMOXA涂层的厚度在2.2 ~ 3.2 nm;接枝密度随PMOXA聚合度的增加而减小,链间距随PMOXA聚合度的增加而增加。在PDA的表面接枝PAA后,PAA涂层的厚度是3.7 nm。混合聚合物刷PMOXA(20)-PAA、PMOXA(40)-PAA和PMOXA(60)-PAA的厚度分别为4.5、3.7 nm和3.5 nm。结果表明,混合聚合物刷的厚度随PMOXA聚合度的增大呈现降低趋势。这里厚度降低趋势是顺序接枝导致的,第一步接枝的PMOXA涂层厚度越大,链长越长,产生的位阻效应则越大,从而使第二步PAA的涂覆量减少,涂层整体厚度降低。由XPS结果可知,混合聚合物刷中的PMOXA聚合度越大,对应涂层的S含量越低,N/O值越大,与厚度结果一致。

    • 固定pH = 9,聚合物修饰前后的硅片分别在I = 0.01 mol/L和I = 0.15 mol/L的溶液中浸泡之后的静态水接触角如图3所示。裸硅片分别在I = 0.01 mol/L和I = 0.15 mol/L溶液中浸泡后,接触角均在6° ~ 9°,表明裸硅片经Piranha溶液清洗之后,亲水性增强。表面涂覆PDA之后,分别在I = 0.01 mol/L和I = 0.15 mol/L溶液中浸泡后,接触角分别增至39°和37°。当PMOXA接枝到PDA表面后,分别在I = 0.01 mol/L和I = 0.15 mol/L溶液中浸泡后,接触角均低于15°,表明PMOXA涂层具有良好的亲水性。随着PMOXA聚合度从20增加至60,接触角从14°下降至6°,表明PMOXA的聚合度越大,涂层的亲水性越强。当PAA接枝到PDA表面后,在I = 0.01 mol/L溶液中浸泡后,接触角为52°;在I = 0.15 mol/L溶液中浸泡后,接触角下降至27°。高离子强度下,静电屏蔽效应会造成PAA链塌缩,同时高离子强度可能降低固液界面张力,促使PAA表面的接触角降低[31]。对于PMOXA-PAA混合聚合物刷,在I = 0.01 mol/L溶液中浸泡后,随着PMOXA的聚合度从20增加至60,接触角从52°降低至41°;在I = 0.15 mol/L溶液中浸泡后,混合聚合物刷的接触角均下降至20°以下,PMOXA(60)-PAA刷表面接触角仅为13°。上述结果表明,当I = 0.01 mol/L时,混合聚合物刷中PAA链处于伸展状态,居于混合聚合物刷上层,使表面疏水性增加;当I = 0.15 mol/L时,由于离子强度的增加,使PAA链塌缩,此时PMOXA链居于混合聚合物刷上层,使涂层表面亲水性增强。因此通过环境条件的调控,可控制PMOXA-PAA混合聚合物刷的构象,从而达到调节涂层性能的目的。

      图  3  裸硅片和修饰硅片的WCA值

      Figure 3.  WCA values of bare and modified silicon wafers

    • 涂层亲疏水性研究结果表明,在pH = 9、I = 0.01 mol/L和pH = 9、I = 0.15 mol/L条件下,混合聚合物刷表面分别由PAA链和PMOXA链起主导作用,因此可将此条件分别作为纤维蛋白在混合聚合物刷表面吸附和脱附的实验条件。首先通过荧光显微镜定性研究了聚合物刷对纤维蛋白的吸附-脱附行为。固定pH = 9,裸玻璃片和修饰玻璃片在I = 0.01 mol/L和I = 0.15 mol/L条件下吸附FITC-Fib的荧光图像和相对荧光强度如图4所示(将pH = 9、I = 0.01 mol/L条件下,PAA修饰玻璃片吸附FITC-Fib的相对荧光强度定为100%)。在I = 0.01 mol/L条件下,裸玻璃片表面的大量荧光表明裸玻璃片表面吸附了大量的纤维蛋白,并且在I = 0.15 mol/L条件下,荧光强度并无明显改变。经PDA修饰后,荧光强度降低,且在吸附和脱附条件下无明显差异。接枝PMOXA后,在2种条件下荧光强度都非常低,表明PMOXA可以有效阻抗纤维蛋白的吸附,而且随PMOXA聚合度增加,荧光强度降低,PMOXA(60)刷的荧光强度仅为0.1%。将PAA接枝到PDA表面后,在I = 0.01 mol/L条件下,PAA涂层的荧光强度为100%,表明PAA涂层会大量吸附纤维蛋白。在I = 0.15 mol/L条件下,荧光强度下降,脱附率为45%。对于PMOXA-PAA混合聚合物刷,在I = 0.01 mol/L条件下,都呈现了较强的荧光,而且随着PMOXA聚合度的增大,荧光强度下降。表明混合聚合物刷依然对纤维蛋白保持了较高的吸附量,且随着混合聚合物刷中PMOXA聚合度的增加,纤维蛋白吸附量呈现下降趋势。在I = 0.15 mol/L条件下,相对荧光强度下降,且PMOXA的聚合度越大,下降越明显,表明纤维蛋白的脱附率越高,PMOXA(60)-PAA刷对纤维蛋白可达到90%以上的脱附率。

      图  4  (a)裸玻璃片和修饰玻璃片吸附FITC-Fib的荧光图像 (b)相应荧光照片的相对荧光强度

      Figure 4.  (a) Fluorescence images of FITC-Fib adsorbed on bare glass and modified glass (b) Relative fluorescence intensities of above images

      为了进一步研究蛋白质在选定条件下在材料表面的吸附,采用SPR对纤维蛋白的吸附-脱附行为进行了实时研究。固定pH = 9、I = 0.01 mol/L,纤维蛋白在裸金片和不同聚合度PMOXA涂层金片表面上的吸附曲线如图5所示。裸金片对纤维蛋白的吸附量是681.9 ng/cm2,而PMOXA刷对纤维蛋白的吸附量随PMOXA聚合度的增加而下降,PMOXA(60)刷的吸附量降低至67.7 ng/cm2,相对裸金片,纤维蛋白的吸附量下降了90.1%。结果表明PMOXA刷能有效抑制纤维蛋白的吸附,并且抑制效果随着PMOXA聚合度的增大而增强。根据图3的结果可知,PMOXA的聚合度越大,涂层表面的亲水性就越强,亲水性的提高能明显改善聚合物涂层的抗污能力。与此同时,PMOXA链长的增加会产生更多的空间位阻效应,能有效增强与蛋白质之间的体积排斥作用,从而提高涂层的抗污性能[32, 33]

      图  5  纤维蛋白在裸金片和不同聚合度PMOXA涂层金片上吸附的SPR图

      Figure 5.  SPR sensorgram of fibrinogen adsorption on bare and PMOXA-coated gold surface with different degrees of polymerization

      聚合物刷分别在pH = 9、I = 0.01 mol/L和pH 9、I = 0.15 mol/L下对纤维蛋白的吸附-脱附SPR过程如图6所示,吸附量(Δmadsorption)和脱附后剩余量(Δmafter desorption)以及脱附率[(Δmadsorption−Δmafter desorption)/ Δmadsorption×100%]结果如表2所示。裸金片的吸附量为681.9 ng/cm2,脱附率为17.7%。PDA修饰之后,吸附量增至780.7 ng/cm2,脱附率为1.3%。接枝上PAA之后,涂层对纤维蛋白的吸附量达到1318.9 ng/cm2,脱附率为44.3%。当混合聚合物刷中PMOXA聚合度从20增大至60,对纤维蛋白的吸附量从1 238.8 ng/cm2降低至806.8 ng/cm2,但脱附率从66.6%提高至83.5%。

      图  6  纤维蛋白在PMOXA(60)-PAA混合聚合物刷表面吸附-脱附的SPR图

      Figure 6.  SPR sensorgram of fibrinogen adsorption and desorption on PMOXA(60)-PAA mixed polymer brush surface

      SamplesΔmadsorption/(ng·cm−2Δmafter desorption/(ng·cm−2Desorption percentage/%
      Bare gold681.9561.417.7
      PDA780.7770.01.3
      PAA1318.9735.044.3
      PMOXA(20)-PAA1238.8413.566.6
      PMOXA(40)-PAA978.0218.477.7
      PMOXA(60)-PAA806.8132.983.5

      表 2  根据SPR数据计算纤维蛋白吸附量、脱附后剩余量和脱附率

      Table 2.  Mass of fibrinogen adsorption, remaining mass after desorption, and resultant desorption percentage based on SPR data

      结合混合聚合物刷表面亲疏水性研究实验和纤维蛋白的定性定量研究实验,推测混合聚合物刷对纤维蛋白吸附和脱附的可能机理如图7所示。在pH = 9、I = 0.01 mol/L条件下,PAA链在水溶液中伸展并带有负电荷,同时所有混合聚合物刷中PAA的链长(25.12 nm)都较PMOXA的链长长(聚合度20、40和60的PMOXA链长分别为7.24、14.49 nm和21.73 nm),因此,PAA链居于混合聚合物刷上层,在混合聚合物刷中起着主导作用,尽管此时环境pH高于纤维蛋白的等电点(纤维蛋白的IEP约为5.8),纤维蛋白净电荷为负电荷,但是由于其不均匀的电荷分布,使其带有正电荷的末端侧臂仍会与上层PAA链发生侧向吸附[8, 13]。从表1的结果可知,随着混合聚合物刷中PMOXA的聚合度增加,PMOXA层的厚度增大,PAA接枝密度降低,因此纤维蛋白的吸附量随PMOXA聚合度增加而出现下降趋势。在pH = 9、I = 0.15 mol/L条件下,高离子强度产生静电屏蔽效应,引起PAA链的塌缩,促使纤维蛋白脱附,同时暴露在混合聚合物刷中上层的PMOXA链使涂层亲水性显著提高,进一步阻抗纤维蛋白的吸附。从图5的结果可知,PMOXA对纤维蛋白的阻抗能力随PMOXA的聚合度增加而增大,所以混合聚合物刷对纤维蛋白的脱附率也随PMOXA聚合度的增加而增大。对于PMOXA(60)-PAA刷,此时在PAA链塌缩、长链PMOXA优异的亲水性和抗蛋白质排斥体积效应的协同作用下,对纤维蛋白脱附率高达83.5%,实现了对蛋白质的吸附和释放功能的调控。该条件下的高脱附率也表明PAA链在高离子强度下的塌缩没有受到PMOXA链之间的位阻效应干扰,体现了PMOXA/PAA混合聚合物刷的高效性和可控性。

      图  7  混合聚合物刷对纤维蛋白吸附和脱附的可能机理

      Figure 7.  Possible mechanism of adsorption and desorption of fibrinogen on mixed brushes

    • (1)在不同基底表面制备了组成可控的PMOXA/PAA混合聚合物刷。

      (2)当环境条件由pH = 9、I = 0.01 mol/L向pH = 9、I = 0.15 mol/L转变时,混合聚合物刷表面会从相对疏水状态转变为亲水状态。

      (3)增加PMOXA的聚合度会减少混合聚合物刷对蛋白质的吸附量,同时也会增加混合聚合物刷对蛋白质的脱附率。

      (4)聚合度60的PMOXA和聚合度90的PAA以质量比3∶2顺序接枝制备的混合聚合物刷,对纤维蛋白的脱附率可达到83.5%。

参考文献 (33)

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