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两性离子多肽改善GLP-1生物活性的粗粒化分子模拟

滕家曼 刘玉婷 朱国梁 谌庄琳 陈彦涛

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两性离子多肽改善GLP-1生物活性的粗粒化分子模拟

    作者简介: 滕家曼(1998—),女,硕士生,研究方向为生物大分子的分子模拟。E-mail:tengjiaman@foxmail.com;陈彦涛,博士,任职于深圳大学化学与环境工程学院。长期从事生物医药材料的计算机模拟研究,近年来致力发展多尺度计算模型,并用于探讨药物蛋白控制释放的微观机理。主持完成多项国家自然科学基金及省市科技计划项目。先后被认定为深圳市高层次专业人才(地方级),入选广东省高等学校“千百十工程”人才培养计划。以第一作者/通讯作者在Acta Biomaterialia、International Journal of Biological Macromolecules、Journal of Physical Chemistry C 、Langmuir等学术期刊上发表SCI论文30余篇,以第一发明人授权中国发明专利1件.
    通讯作者: 陈彦涛, ytchen@szu.edu.cn
  • 中图分类号: O617

Coarse-Grained Molecular Simulation of Zwitterionic Polypeptides on Improving the Bioactivity of Glucagon-Like Peptide-1(GLP-1)

    Corresponding author: CHEN Yantao, ytchen@szu.edu.cn
  • CLC number: O617

  • 摘要: 以胰高血糖素样肽-1(GLP-1)与多肽的混合体系作为研究对象,利用粗粒化分子模拟对其作用模式进行研究。结果显示,3种混合体系都有利于GLP-1形成螺旋结构。其中,两性离子五肽VPKEG具有较强亲水性,在GLP-1周围形成疏松的保护层;而两性离子五肽VPREG与GLP-1形成较多静电作用;对照组五肽VPGAG具有较强疏水性,形成致密聚集体,未能给GLP-1提供足够保护。赖氨酸、谷氨酸组合让两性离子五肽VPKEG具备了恰当的亲疏水性和静电作用,既能维持GLP-1构象,也可避免被免疫蛋白识别,赋予其“隐身”特性。
  • 图 1  各模拟体系中GLP-1蛋白的二级结构随时间的变化情况

    Figure 1.  Time evaluation of the secondary structures for GLP-1 protein in different simulated systems

    图 2  各模拟体系中五肽的原子接触数(Atomic contact)随时间的变化情况:(a)五肽与水溶剂的接触数;(b)五肽与GLP-1蛋白的接触数

    Figure 2.  Time evaluation of the atomic contacts for pentapeptides with (a) water and (b) GLP-1 protein in different simulated systems

    图 3  热力学平衡后,各模拟体系中GLP-1蛋白的(a)二级结构分布及(b)末端距

    Figure 3.  Distribution of (a) secondary structures and (b) end-to-end distance of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

    图 4  热力学平衡后,各模拟体系中GLP-1蛋白的典型构象

    Figure 4.  Typical conformation of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

    图 5  (a)五肽在GLP-1周围的径向分布情况;(b)GLP-1各个残基与多肽的原子接触情况

    Figure 5.  (a) Radial distribution functions (RDF) of around GLP-1; (b) Atomic contacts with pentapeptides for each residue of GLP-1

    图 6  各模拟体系中多肽在GLP-1蛋白周围的典型分布

    Figure 6.  The typical distribution of pentapeptides around GLP-1 protein in different simulated systems

    图 7  各模拟体系中静电相互作用情况

    Figure 7.  The electrostatic interactions among GLP-1 protein and pentapeptides in different simulated systems

    图 8  各模拟体系中五肽各残基与GLP-1蛋白的原子接触数

    Figure 8.  Number of atomic contacts with GLP-1 for each residue of pentapeptide

    图 9  水分子在两性离子多肽特定残基周围的径向分布:(a)赖氨酸及精氨酸侧基N原子周围的水分子分布;(b)谷氨酸侧基O原子周围的水分子分布

    Figure 9.  Radial distribution of water molecules around some spec residues of zwitterionic pentapeptides: (a) The distribution of water molecules around N atoms of the side groups of LYS and ARG; (b) The distribution of water molecules around the O atom of the side groups of GLU

    图 10  各模拟体系中GLP-1蛋白的动力学性质:(a)各残基的根均方的涨落情况;(b)GLP-1均方位移随时间变化情况

    Figure 10.  Kinetic properties of GLP-1 protein in different simulated system: (a) The root-mean-squared fluctuation (RMSF) of each residue;(b) The mean-squared displacement (MSD) of GLP-1 as functions time

  • [1] ZELIKIN A N, EHRHARDT C, HEALY A M. Materials and methods for delivery of biological drugs [J]. Nat Chem,2016,8(11):997-1007. doi: 10.1038/nchem.2629
    [2] KO J H, MAYNARD H D. A guide to maximizing the therapeutic potential of protein-polymer conjugates by rational design [J]. Chem Soc Rev,2018,47(24):8998-9014. doi: 10.1039/C8CS00606G
    [3] HARRIS J M, CHESS R B. Effect of pegylation on pharmaceuticals [J]. Nat Rev Drug Discov,2003,2(3):214-221. doi: 10.1038/nrd1033
    [4] ZAMAN R, ISLAM R A, IBNAT N, et al. Current strategies in extending half-lives of therapeutic proteins [J]. J Control Release,2019,301:176-189. doi: 10.1016/j.jconrel.2019.02.016
    [5] ZHANG P, SUN F, LIU S, et al. Anti-PEG antibodies in the clinic: Current issues and beyond PEGylation [J]. J Control Release,2016,244:184-193. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.06.040
    [6] QI Y, CHILKOTI A. Protein-polymer conjugation-moving beyond PEGylation [J]. Curr Opin Chem Biol,2015,28:181-193. doi: 10.1016/j.cbpa.2015.08.009
    [7] 张冲, 吕华. 蛋白质-聚氨基酸偶联物的高效合成与应用 [J]. 高分子学报,2018,31(1):21-31. doi: 10.11777/j.issn1000-3304.2018.17204Zhang Chong and Lu Hua. Efficient Synthesis and Application of Protein-Poly(α-amino acid) Conjugates [J]. Acta Polymerica Sinica,2018,31(1):21-31. doi: 10.11777/j.issn1000-3304.2018.17204
    [8] 闫树鹏, 张冲, 吕华. 两性离子聚合物的研究进展 [J]. 功能高分子学报,2020,33(4):1-14.YAN Shupeng, ZHANG Chong, LYU Hua. Advances in Zwitterionic Polymers [J]. Journal of Functional Polymers,2020,33(4):1-14.
    [9] WHITE A D, NOWINSKI A K, HUANG W J, et al. Decoding nonspecific interactions from nature [J]. Chem Sci,2012,3(12):3488-3494. doi: 10.1039/c2sc21135a
    [10] KEEFE A J, CALDWELL K B, NOWINSKI A K, et al. Screening nonspecific interactions of peptides without background interference [J]. Biomaterials,2013,34(8):1871-1877. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.11.014
    [11] LIU E J, SINCLAIR A, KEEFE A J, et al. EKylation: Addition of an alternating-charge peptide stabilizes proteins [J]. Biomacromolecules,2015,16(10):3357-3361. doi: 10.1021/acs.biomac.5b01031
    [12] LIU E J, JIANG S. Expressing a monomeric organophosphate hydrolase as an EK fusion protein [J]. Bioconjug Chem,2018,29(11):3686-3690. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.8b00607
    [13] BANSKOTA S, YOUSEFPOUR P, KIRMANI N, et al. Long circulating genetically encoded intrinsically disordered zwitterionic polypeptides for drug delivery [J]. Biomaterials,2019,192:475-485. doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.11.012
    [14] SHAO Q, HE Y, WHITE A D, et al. Different effects of zwitterion and ethylene glycol on proteins [J]. J Chem Phys,2012,136(22):225101.
    [15] SETTANNI G, ZHOU J, SUO T, et al. Protein corona composition of poly(ethylene glycol)- and poly(phosphoester)-coated nanoparticles correlates strongly with the amino acid composition of the protein surface [J]. Nanoscale,2017,9(6):2138-2144. doi: 10.1039/C6NR07022A
    [16] GODDARD T D, HUANG C C, MENG E C, et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis [J]. Protein Sci,2018,27(1):14-25. doi: 10.1002/pro.3235
    [17] HAN W, WAN C K, JIANG F, et al. PACE force field for protein simulations. 1. Full parameterization of version 1 and verification [J]. J Chem Theory Comput,2010,6(11):3373-3389. doi: 10.1021/ct1003127
    [18] HAN W, WAN C K, WU Y D. PACE force field for protein simulations. 2. Folding simulations of peptides [J]. J Chem Theory Comput,2010,6(11):3390-3402. doi: 10.1021/ct100313a
    [19] XIONG Q, JIANG Y, CAI X, et al. Conformation dependence of diphenylalanine self-assembly structures and dynamics: Insights from hybrid-resolution simulations [J]. ACS Nano,2019,13(4):4455-4468. doi: 10.1021/acsnano.8b09741
    [20] ABRAHAM M J, MURTOLA T, SCHULZ R, et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers [J]. SoftwareX,2015,1-2:19-25. doi: 10.1016/j.softx.2015.06.001
    [21] HUMPHREY W, DALKE A, SCHULTEN K. VMD: Visual molecular dynamics[J]. Journal of Molecular Graphics, 1996, 14 (1): 33 (8), 27-28.
    [22] DELANO W L. The PyMOL Molecular Graphics System; DeLano Scientific: San Carlos, CA, USA, 2002.
    [23] MANANDHAR B, AHN J M. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogs: Recent advances, new possibilities, and therapeutic implications [J]. J Med Chem,2015,58(3):1020-1037. doi: 10.1021/jm500810s
    [24] UNDERWOOD C R, GARIBAY P, KNUDSEN L B, et al. Crystal structure of glucagon-like peptide-1 in complex with the extracellular domain of the glucagon-like peptide-1 receptor [J]. J Biol Chem,2010,285(1):723-730. doi: 10.1074/jbc.M109.033829
    [25] THORNTON K, GORENSTEIN D G. Structure of glucagon-like peptide (7-36) amide in a dodecylphosphocholine micelle as determined by 2D NMR [J]. Biochemistry,1994,33(12):3532-3539. doi: 10.1021/bi00178a009
    [26] CHANG X, KELLER D, BJØRN S, et al. Structure and folding of glucagon-like peptide-1-(7-36)-amide in aqueous trifluoroethanol studied by NMR spectroscopy [J]. Magnetic Resonance in Chemistry,2001,39(8):477-483. doi: 10.1002/mrc.880
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-18
  • 网络出版日期:  2021-03-08

两性离子多肽改善GLP-1生物活性的粗粒化分子模拟

    通讯作者: 陈彦涛, ytchen@szu.edu.cn
    作者简介: 滕家曼(1998—),女,硕士生,研究方向为生物大分子的分子模拟。E-mail:tengjiaman@foxmail.com;陈彦涛,博士,任职于深圳大学化学与环境工程学院。长期从事生物医药材料的计算机模拟研究,近年来致力发展多尺度计算模型,并用于探讨药物蛋白控制释放的微观机理。主持完成多项国家自然科学基金及省市科技计划项目。先后被认定为深圳市高层次专业人才(地方级),入选广东省高等学校“千百十工程”人才培养计划。以第一作者/通讯作者在Acta Biomaterialia、International Journal of Biological Macromolecules、Journal of Physical Chemistry C 、Langmuir等学术期刊上发表SCI论文30余篇,以第一发明人授权中国发明专利1件
  • 深圳大学化学与环境工程学院,深圳市环境化学与生态修复重点实验室,广东 深圳 518071

摘要: 以胰高血糖素样肽-1(GLP-1)与多肽的混合体系作为研究对象,利用粗粒化分子模拟对其作用模式进行研究。结果显示,3种混合体系都有利于GLP-1形成螺旋结构。其中,两性离子五肽VPKEG具有较强亲水性,在GLP-1周围形成疏松的保护层;而两性离子五肽VPREG与GLP-1形成较多静电作用;对照组五肽VPGAG具有较强疏水性,形成致密聚集体,未能给GLP-1提供足够保护。赖氨酸、谷氨酸组合让两性离子五肽VPKEG具备了恰当的亲疏水性和静电作用,既能维持GLP-1构象,也可避免被免疫蛋白识别,赋予其“隐身”特性。

English Abstract

  • 蛋白质药物具有生物活性高、特异性强及毒副作用小等优点,但在临床应用过程中也遇到了一系列问题[1]。比如蛋白药物通常热稳定性差,需要同时面对肾脏过滤及蛋白酶解作用,导致药代动力学严重低于预期。作为一种提升蛋白药物体内半衰期的修饰方法,利用共价键在蛋白质表面缀合高分子长链,有效推动了医药产业的发展[2]。蛋白质-聚乙二醇(PEG)偶联物是目前最成功的偶联物形式,其PEG长链以无规线团的形式把目标蛋白包覆、保护起来,成功延长其体内循环半衰期至10~100倍[3]。目前已有十几种蛋白-PEG偶联物作为长效药物获得了上市批准,被应用于糖尿病、肝炎等重大恶疾的临床治疗[4]。但PEG自身不可生物降解,易在肾脏中聚集,长期给药易导致免疫应答甚至较高的肝脏脂肪含量[5]。利用化学或生物手段,寻找具有低免疫原性、可生物降解的PEG替代物是目前该领域亟待解决的难点[6, 7]

    作为一种潜在的PEG替代物,两性离子多肽(ZIPP)近年来获得了极大关注。ZIPP保持了多肽链的先天优势,如可生物降解、可序列设计等。另一方面,与两性离子聚合物类似[8],ZIPP在序列中含有等摩尔比的阳离子残基(如赖氨酸)和阴离子残基(如谷氨酸),空间上近邻的正负电荷赋予ZIPP优良的亲水性、抗吸附特性及“隐身”能力,有效增加了在血浆中的停留时间[9]。Jiang课题组首先揭示了以赖氨酸和谷氨酸为重复单元的聚多肽poly(KE)有着最强的抗吸附能力[10];其与内酰胺酶形成偶联物后,后者的环境耐受性及催化活性都得到大幅度提高[11, 12]。2019年,Chilkoti课题组[13]利用类弹性蛋白聚多肽(ELP)修饰胰高血糖素样肽GLP-1后,体内半衰期延长了71倍;对ELP序列进行突变,获得两性离子多肽ZIPP,其偶联物生物活性再次提高1.7倍,体内半衰期由5~6 h延长到12 h[13]。现有的偶联物构效关系认为[3],长链高分子具有无规线团构象,其把目标蛋白包覆起来后,有效避免了肾脏清除和酶解作用,但也阻碍了目标蛋白与其受体的有效结合。而Chilkoti课题组[13]的实验研究说明,在相同分子量或类似空间尺寸情况下,两性离子特性也能够提高偶联物药效动力学特性。受限于仪器分辨率,相关实验研究仍然停留在宏观或介观层面,尚不能在分子层面上给出结构与功能的关系。

    本文借助于分子模拟手段,以GLP-1蛋白为研究对象,试图在微观层面揭示出两性离子多肽与GLP-1蛋白的相互作用模式,探究ZIPP与普通多肽(如ELP)在物理化学性质上的差异。一般来说,蛋白偶联物的药代动力学行为受到多重因素的影响,如高分子链的链长、序列差异及接枝位点等。已有模拟研究中,乙二醇寡聚物,而非长链高分子,被成功用来探究PEG与目标蛋白的相互作用模式[14, 15],这有效避免了其它因素对研究对象的干扰。考虑到两性离子长链多肽也呈无规线团状构象[13],本文采取了类似的策略,利用五肽与GLP-1蛋白的混合体系,试图研究ZIPP五肽与GLP-1的相互作用模式。研究结果显示,3种五肽都能够有效稳定GLP-1蛋白的螺旋构象;尤其是含有赖氨酸和谷氨酸的ZIPP五肽,其适当的疏水性和静电相互作用,既能够有效保护GLP-1蛋白,也不易被其它物质识别而表现出“隐身”特性。

    • 本文研究对象GLP-1及五肽的序列信息参考了Chilkoti课题组[13]的相关实验研究。GLP-1的氨基酸序列为AAHGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGAG,是内源性GLP-1的突变体,在体内有着更高的稳定性。3种五肽序列为:VPGAG、VPKEG和VPREG,文中分别简写为GA-pep、KE-pep和RE-pep。其中,GA-pep可以看做是类弹性蛋白多肽(ELP)的充分单元,而KE-PEP和RE-PEP是两性离子多肽(ZIPP)。

      研究对象GLP-1及五肽的初始结构由Chimera软件[16]生成。GLP-1被设置为α-螺旋结构,肽平面二面角夹角分别为:Φ = 57°, Ψ = 47°;3种五肽被设置为β-片层结构,肽平面二面角夹角分别为:Φ = 139°, Ψ = 135°。为避免链末端的电荷影响,五肽N端和C端分别被乙酰基和酰胺基封端。

      本文以GLP-1与五肽的混合体系为主要研究对象,分别称为GLP@GA、GLP@KE、GLP@RE。体系中GLP-1的浓度为7.9 mol/L,GLP-1与五肽的摩尔比为1∶40。作为对照组,本文也对不含五肽的GLP-1水溶液进行了模拟,该体系简称为GLP@WAT。

    • 考虑到GLP-1与五肽的混合物体系较为庞大,本文使用粗粒化力场PACE(ver 1.3)[17, 18]加速模拟进程。PACE力场由吴云东院士及韩伟教授主导开发,其忽略了蛋白质中的非极性氢,但是保留了蛋白质的大部分原子细节,同时对水分子进行了粗粒化处理。其势能函数(E)表示如下:

      $ \begin{array}{l} {E} = {{E}_{{\rm{bond}}}} + {{E}_{{\rm{angle}}}} + {{E}_{{\rm{dihedral}}}} + {{E}_{{\rm{improper}}}} + {{E}_{\phi ,\psi ,\chi 1}}\\ + {{E}_{{\rm{polar}}}} + {{E}_{{\rm{non}} - {\rm{polar}}}} + {{E}_{{\rm{CGW}} - {\rm{CGW}}}} + {{E}_{{\rm{CGW}} - {\rm{UA}}}} \end{array}$

      式中的能量项既考虑了残基间的近程相互作用($ {E}_{\mathrm{b}\mathrm{o}\mathrm{n}\mathrm{d}} $表示键长,$ {E}_{\mathrm{a}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{l}\mathrm{e}} $表示键角,$ {E}_{\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{h}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{l}} $$ {E}_{\mathrm{i}\mathrm{m}\mathrm{p}\mathrm{r}\mathrm{o}\mathrm{p}\mathrm{e}\mathrm{r}} $表示二面角,$ {E}_{\mathrm{\phi },\mathrm{\psi },\mathrm{\chi }1} $表示旋转偏差);同时也包含了残基间远程相互作用,如$ {E}_{\mathrm{p}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{a}\mathrm{r}} $表示的极性库伦相互作用和$ {E}_{\mathrm{n}\mathrm{o}\mathrm{n}-\mathrm{p}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{a}\mathrm{r}} $表示的非极性范德华相互作用;此外,还囊括了$ {E}_{\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{W}-\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{W}} $表示的粗粒化水分子(CGW)之间,以及$ {E}_{\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{W}-\mathrm{U}\mathrm{A}} $表示的水与残基之间的非共价相互作用。到目前为止,PACE粗粒化模型已被成功应用于对蛋白质折叠、多肽自组装、蛋白-多肽相互作用研究[19]

    • 本工作的所有模拟都基于GROMACS软件包(ver 2018.1)[20]来进行。在210 nm3的立方盒子内,先把GLP-1蛋白放置于中央,将40条五肽随机插入到盒子内,继续加入钠离子和氯离子使得体系整体呈电中性,并设置NaCl最终浓度为0.1 mol/L。盒子中充满水分子,且所有原子的运动符合周期性边界条件。

      正式的分子模拟可分为3个阶段:能量最小化、热力学弛豫及成品模拟。在能量最小化阶段,利用最速下降法对模拟体系进行5000步的能量优化。在热力学弛豫阶段,将模拟体系温度从100 K缓慢升到310 K,模拟步长设置为2 fs,该过程持续500 ps,并对蛋白质进行位置限制,力常数设置为1000 kJ/nm,且体系体积保持不变。在成品模拟阶段,将体系放置在恒温恒压系综中进行模拟,系统温度和压力分别保持在310 K和1 bar,模拟步长为5 fs,该过程持续1000 ns。

      在模拟运行过程中,每10步更新一次近邻列表,短程近邻列表的阈值为1.2 nm。非键范德华相互作用及长程静电相互作用的阈值为1.2 nm,相对介电常数设为15。利用Nose-Hoover方法及Parrinello-Rahman方法维持体系的温度和压力在设定值,耦合时间常数分别为1.0 ps和2.0 ps。

      本研究中的4个模拟体系各进行了两次分子动力学模拟,总模拟时间超过8000 ns。

    • 成品模拟的最后200 ns的模拟被用来开展数据分析。利用VMD软件[21]的Timeline模块获得蛋白质二级结构的时间演化趋势;利用GROMACS的聚类函数获取模拟体系的典型构象,进一步使用PyMol软件[22]对构象进行渲染;利用GROMACS软件自带的分析模块获取体系的径向分布函数(RDF)、原子接触(atomic contact)、GLP-1蛋白的位置涨落(RMSF)、均方位移(MSD)及末端距(Distance)。GLP-1蛋白的末端距定义为N端α碳与C端α碳之间的距离。参考文献[19],当氨基N原子与羰基O原子之间距离小于0.32 nm时,定义为发生静电相互作用;当残基原子与和水原子之间的距离小于0.5 nm时,定义为发生了原子接触。

    • 已有研究显示,游离态的GLP-1蛋白不具有稳定的二级结构[23];而GLP-1蛋白与受体结合后,以长螺旋的形式存在[24]。在五肽存在的情况下,GLP-1蛋白空间构象如何变化,至今未有相关的实验研究。本研究中,GLP-1蛋白和五肽的初始构象分别被设定为α-螺旋和β-片层结构。由图1(a)可知,模拟开始后,游离GLP-1的构象变得非常不稳定,初始螺旋结构被分子热运行迅速破坏。由图1(b, c, d)可知,体系中引入40条五肽后,GLP-1蛋白的螺旋结构得以稳定;尤其在GLP@RE体系中,除两个末端外,GLP-1整体呈现长螺旋结构。

      图  1  各模拟体系中GLP-1蛋白的二级结构随时间的变化情况

      Figure 1.  Time evaluation of the secondary structures for GLP-1 protein in different simulated systems

      为定量观察体系的演化情况,本研究统计了混合体系中五肽与水的接触数。如图2(a)所示,接触数在前100 ns内快速下降,这说明五肽分子能够在短时间内调整空间分布。五肽与GLP-1的接触数(见图2(b))呈现出较大的涨落,但250 ns以后围绕平均值周期性变动,说明整个模拟体系基本到达热力学平衡态。在三个混合物体系中,GA-pep与水形成了最少的接触数,这说明GA-pep具有较强的疏水性,形成了较为致密的聚集体,同时与GLP-1蛋白形成了最多的接触数。KE-pep和RE-pep等两性离子多肽具有一定的亲水性,形成了的聚集体较为疏松;相较而言,KE-pep形成的聚集体最为疏松,与GLP-1蛋白形成了最少的接触数。

      图  2  各模拟体系中五肽的原子接触数(Atomic contact)随时间的变化情况:(a)五肽与水溶剂的接触数;(b)五肽与GLP-1蛋白的接触数

      Figure 2.  Time evaluation of the atomic contacts for pentapeptides with (a) water and (b) GLP-1 protein in different simulated systems

    • 模拟体系进入平衡态后,本研究进一步统计了GLP-1蛋白的末端距及二级结构分布。如图3所示,游离GLP-1蛋白的螺旋比例仅为30.8%,其末端距也最小(0.67 nm);而在得到五肽保护后,其螺旋比例明显提高。相比GA-pep,ZIPP更有利于GLP-1形成螺旋构象;特别是在GLP@KE体系中,螺旋比例增加到60.4%,近乎两倍于GLP@WAT体系。图4给出了GLP-1在不同体系中的典型构象。游离GLP-1蛋白的整体构象呈现为无规线团,N端与C端相互靠拢,呈闭环状,并形成少量β-片(见图1(a))。引入五肽后,GLP-1蛋白的两个末端被迫分开,增强了形成螺旋的概率;尤其是在GLP@RE体系中,GLP-1形成了单根长螺旋。而在GLP@GA和GLP@KE体系中,GLP-1蛋白形成了多个短螺旋。

      图  3  热力学平衡后,各模拟体系中GLP-1蛋白的(a)二级结构分布及(b)末端距

      Figure 3.  Distribution of (a) secondary structures and (b) end-to-end distance of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

      图  4  热力学平衡后,各模拟体系中GLP-1蛋白的典型构象

      Figure 4.  Typical conformation of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

      综合图1图3,GLP-1蛋白N端片段倾向于形成线团(coil)或转折(turn)等结构,而多肽片段Asp15-Val33是否形成螺旋则依赖于微环境。相关实验也发现了类似规律,如Thornton等人[25]发现十二烷基磷胆碱(DPC)胶束有助于GLP-1形成含有两个螺旋片段的构象,而Chang等人[26]发现三氟乙醇水溶液有助于GLP-1形成单个长螺旋构象。

    • 本研究利用径向分布函数(gr))探讨了五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况(见图5(a))。GA-pep在形成致密聚集体的同时,也倾向于紧紧包围在GLP-1蛋白表面,因而在r = 0.5 nm附近呈现最高峰;KE-pep倾向于分散在水溶液中,从而远离GLP-1蛋白表面。图5(b)显示,五肽主要与GLP-1的10-12位残基和C端螺旋发生接触,而很少能接触到GLP-1蛋白的中间序列部分,这也说明五肽聚集体并没有完全把GLP-1蛋白包埋。

      图  5  (a)五肽在GLP-1周围的径向分布情况;(b)GLP-1各个残基与多肽的原子接触情况

      Figure 5.  (a) Radial distribution functions (RDF) of around GLP-1; (b) Atomic contacts with pentapeptides for each residue of GLP-1

      图6(a~c)给出了3个混合体系的模拟快照(snapshot),更直观地显示出五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况。GA-pep形成了较为致密的聚集体,只对GLP-1蛋白的两个末端形成了局部包覆,混合体系整体呈现左右结构;KE-pep形成的聚集体非常疏松,均匀分布在GLP-1蛋白周围,但是只与两个末端形成原子接触,混合体系整体呈现核壳结构;RE-pep聚集体介乎其间,更接近GA-pep情形,只与GLP-1蛋白两个末端形成原子接触。本研究还对五肽分子单独存在的溶液体系进行了粗粒化模拟。经过500 ns的热力学松弛,3种五肽分子在水溶液中呈现出了不同的聚集状态,如图6(e~f)所示。与混合体系模拟结果,可见3种五肽分子的不同聚集行为与是否引入GLP-1蛋白无关;换言之,五肽分子的内在特性决定了五肽与目标蛋白之间的相互作用模式。

      图  6  各模拟体系中多肽在GLP-1蛋白周围的典型分布

      Figure 6.  The typical distribution of pentapeptides around GLP-1 protein in different simulated systems

    • 为继续探究五肽形成聚集体及包覆GLP-1蛋白的驱动力,本文统计了混合体系内的静电相互作用情况。由图7可见,KE-pep与GLP-1蛋白形成了最少的静电作用,同时KE-pep聚集体内部也形成最少的静电作用,这充分说明KE-pep具有最高的亲水性,倾向于均匀分散在水溶液中。RE-pep聚集体内部形成了最多的静电作用,但与GLP-1的静电作用稍微低于GLP@GA体系,这体现了驱动力的差异:RE-pep以静电作用作为形成聚集体的主要驱动力,而GA-pep同时利用静电及疏水作用形成致密聚集体,并以此与GLP-1形成最多的原子接触。相比游离GLP-1蛋白,与五肽混合后,其两个末端被迫分开,内部静电作用稍有减少。

      图  7  各模拟体系中静电相互作用情况

      Figure 7.  The electrostatic interactions among GLP-1 protein and pentapeptides in different simulated systems

      为了探究五肽中各残基对驱动力的贡献,本文进一步统计了各残基与GLP-1的原子接触数。如图8所示,GA-pep中Gly3和Ala4与GLP-1形成了最多的接触,而Val1和Pro2与GLP-1形成了最少的接触,这说明疏水性强的Val1和Pro2相互靠拢,驱动GA-pep形成致密聚集体;其C端朝外,与GLP-1蛋白形成接触。相比KE-pep,RE-pep的Val1和Arg3与GLP-1蛋白形成了最多的接触,且明显高于KE-pep对应的残基;这说明,RE-pep的Arg3不但有利于自身形成聚集体,也促进了其与GLP-1蛋白形成局部包覆。

      图  8  各模拟体系中五肽各残基与GLP-1蛋白的原子接触数

      Figure 8.  Number of atomic contacts with GLP-1 for each residue of pentapeptide

      相较GA-pep,两性离子多肽KE-pep和RE-pep都显示了亲水性。本文统计了水分子在ZIPP关键残基周围的径向分布函数。如图9所示,Glu4侧基氧原子周围的水分子密度基本相似,但Lys3侧基氮原子周围的水分子密度明显高于Arg3。这表明KE-pep喜欢分散在水环境中,而富含精氨酸的RE-pep更喜欢与其它残基形成静电作用。

      图  9  水分子在两性离子多肽特定残基周围的径向分布:(a)赖氨酸及精氨酸侧基N原子周围的水分子分布;(b)谷氨酸侧基O原子周围的水分子分布

      Figure 9.  Radial distribution of water molecules around some spec residues of zwitterionic pentapeptides: (a) The distribution of water molecules around N atoms of the side groups of LYS and ARG; (b) The distribution of water molecules around the O atom of the side groups of GLU

    • 本研究使用两个序参量刻画GLP-1蛋白的动力学性质。图10显示,各残基在其位置附近的涨落明显受到了五肽的影响。引入五肽后,GLP-1蛋白序列的中间部分形成了螺旋结构,其位置涨落受到抑制;但其N末端相关残基的位置涨落变动更强烈,尤其是GLP@GA体系,这表明GA-pep聚集体与GLP-1蛋白N端的相互作用稍弱。

      图  10  各模拟体系中GLP-1蛋白的动力学性质:(a)各残基的根均方的涨落情况;(b)GLP-1均方位移随时间变化情况

      Figure 10.  Kinetic properties of GLP-1 protein in different simulated system: (a) The root-mean-squared fluctuation (RMSF) of each residue;(b) The mean-squared displacement (MSD) of GLP-1 as functions time

      水溶液中,GLP-1蛋白与五肽混合后,其扩散能力也必然受到影响。图10计算了不同模拟体系中GLP-1蛋白的均方位移。基于爱因斯坦扩散理论,游离GLP-1的扩散系数为0.13 nm2/ns,与GA-pep、KE-pep或RE-pep混合后,其扩散系数分别降低至0.036 nm2/ns、0.047 nm2/ns及0.014 nm2/ns。可见五肽聚集体明显阻碍了GLP-1在溶液中的扩散,尤其是RE-pep,其聚集体密度低于GA-pep,但最强烈地影响了GLP-1的扩散能力;相比而言,由KE-pep组成的松散外壳对GLP-1的扩散阻力最小。

    • (1)游离GLP-1的两末端相互靠近,形成环状构象,螺旋比例仅为30%;而与五肽混合后,GLP-1两末端倾向于与五肽形成相互作用,中间片段形成较为规整的螺旋结构。

      (2)两性离子五肽VPKEG具有较高的亲水性,倾向于均匀分散在水溶液中,在GLP-1周围形成疏松的保护层。两性离子五肽VPREG以静电作用为主,倾向于相互靠拢形成聚集体,也稳定了GLP-1的长螺旋结构。对照组VPGAG具有较高的疏水性,倾向于形成致密的聚集体,虽然与GLP-1形成了最多的原子接触,但未能充分包埋GLP-1并提供足够的保护。

      (3)赖氨酸、谷氨酸组合让两性离子五肽VPKEG具备了恰当的亲疏水性和静电作用,既能维持GLP-1螺旋构象,也避免了被免疫蛋白识别,赋予其“隐身”特性。

参考文献 (26)

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