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蛋白质药物具有生物活性高、特异性强及毒副作用小等优点,但在临床应用过程中也遇到了一系列问题[1]。比如蛋白药物通常热稳定性差,需要同时面对肾脏过滤及蛋白酶解作用,导致药代动力学严重低于预期。作为一种提升蛋白药物体内半衰期的修饰方法,利用共价键在蛋白质表面缀合高分子长链,有效推动了医药产业的发展[2]。蛋白质-聚乙二醇(PEG)偶联物是目前最成功的偶联物形式,其PEG长链以无规线团的形式把目标蛋白包覆、保护起来,成功延长其体内循环半衰期至10~100倍[3]。目前已有十几种蛋白-PEG偶联物作为长效药物获得了上市批准,被应用于糖尿病、肝炎等重大恶疾的临床治疗[4]。但PEG自身不可生物降解,易在肾脏中聚集,长期给药易导致免疫应答甚至较高的肝脏脂肪含量[5]。利用化学或生物手段,寻找具有低免疫原性、可生物降解的PEG替代物是目前该领域亟待解决的难点[6, 7]。
作为一种潜在的PEG替代物,两性离子多肽(ZIPP)近年来获得了极大关注。ZIPP保持了多肽链的先天优势,如可生物降解、可序列设计等。另一方面,与两性离子聚合物类似[8],ZIPP在序列中含有等摩尔比的阳离子残基(如赖氨酸)和阴离子残基(如谷氨酸),空间上近邻的正负电荷赋予ZIPP优良的亲水性、抗吸附特性及“隐身”能力,有效增加了在血浆中的停留时间[9]。Jiang课题组首先揭示了以赖氨酸和谷氨酸为重复单元的聚多肽poly(KE)有着最强的抗吸附能力[10];其与内酰胺酶形成偶联物后,后者的环境耐受性及催化活性都得到大幅度提高[11, 12]。2019年,Chilkoti课题组[13]利用类弹性蛋白聚多肽(ELP)修饰胰高血糖素样肽GLP-1后,体内半衰期延长了71倍;对ELP序列进行突变,获得两性离子多肽ZIPP,其偶联物生物活性再次提高1.7倍,体内半衰期由5~6 h延长到12 h[13]。现有的偶联物构效关系认为[3],长链高分子具有无规线团构象,其把目标蛋白包覆起来后,有效避免了肾脏清除和酶解作用,但也阻碍了目标蛋白与其受体的有效结合。而Chilkoti课题组[13]的实验研究说明,在相同分子量或类似空间尺寸情况下,两性离子特性也能够提高偶联物药效动力学特性。受限于仪器分辨率,相关实验研究仍然停留在宏观或介观层面,尚不能在分子层面上给出结构与功能的关系。
本文借助于分子模拟手段,以GLP-1蛋白为研究对象,试图在微观层面揭示出两性离子多肽与GLP-1蛋白的相互作用模式,探究ZIPP与普通多肽(如ELP)在物理化学性质上的差异。一般来说,蛋白偶联物的药代动力学行为受到多重因素的影响,如高分子链的链长、序列差异及接枝位点等。已有模拟研究中,乙二醇寡聚物,而非长链高分子,被成功用来探究PEG与目标蛋白的相互作用模式[14, 15],这有效避免了其它因素对研究对象的干扰。考虑到两性离子长链多肽也呈无规线团状构象[13],本文采取了类似的策略,利用五肽与GLP-1蛋白的混合体系,试图研究ZIPP五肽与GLP-1的相互作用模式。研究结果显示,3种五肽都能够有效稳定GLP-1蛋白的螺旋构象;尤其是含有赖氨酸和谷氨酸的ZIPP五肽,其适当的疏水性和静电相互作用,既能够有效保护GLP-1蛋白,也不易被其它物质识别而表现出“隐身”特性。
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本文研究对象GLP-1及五肽的序列信息参考了Chilkoti课题组[13]的相关实验研究。GLP-1的氨基酸序列为AAHGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGAG,是内源性GLP-1的突变体,在体内有着更高的稳定性。3种五肽序列为:VPGAG、VPKEG和VPREG,文中分别简写为GA-pep、KE-pep和RE-pep。其中,GA-pep可以看做是类弹性蛋白多肽(ELP)的充分单元,而KE-PEP和RE-PEP是两性离子多肽(ZIPP)。
研究对象GLP-1及五肽的初始结构由Chimera软件[16]生成。GLP-1被设置为α-螺旋结构,肽平面二面角夹角分别为:Φ = 57°, Ψ = 47°;3种五肽被设置为β-片层结构,肽平面二面角夹角分别为:Φ = 139°, Ψ = 135°。为避免链末端的电荷影响,五肽N端和C端分别被乙酰基和酰胺基封端。
本文以GLP-1与五肽的混合体系为主要研究对象,分别称为GLP@GA、GLP@KE、GLP@RE。体系中GLP-1的浓度为7.9 mol/L,GLP-1与五肽的摩尔比为1∶40。作为对照组,本文也对不含五肽的GLP-1水溶液进行了模拟,该体系简称为GLP@WAT。
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考虑到GLP-1与五肽的混合物体系较为庞大,本文使用粗粒化力场PACE(ver 1.3)[17, 18]加速模拟进程。PACE力场由吴云东院士及韩伟教授主导开发,其忽略了蛋白质中的非极性氢,但是保留了蛋白质的大部分原子细节,同时对水分子进行了粗粒化处理。其势能函数(E)表示如下:
$ \begin{array}{l} {E} = {{E}_{{\rm{bond}}}} + {{E}_{{\rm{angle}}}} + {{E}_{{\rm{dihedral}}}} + {{E}_{{\rm{improper}}}} + {{E}_{\phi ,\psi ,\chi 1}}\\ + {{E}_{{\rm{polar}}}} + {{E}_{{\rm{non}} - {\rm{polar}}}} + {{E}_{{\rm{CGW}} - {\rm{CGW}}}} + {{E}_{{\rm{CGW}} - {\rm{UA}}}} \end{array}$ 式中的能量项既考虑了残基间的近程相互作用(
$ {E}_{\mathrm{b}\mathrm{o}\mathrm{n}\mathrm{d}} $ 表示键长,$ {E}_{\mathrm{a}\mathrm{n}\mathrm{g}\mathrm{l}\mathrm{e}} $ 表示键角,$ {E}_{\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{h}\mathrm{e}\mathrm{d}\mathrm{r}\mathrm{a}\mathrm{l}} $ 和$ {E}_{\mathrm{i}\mathrm{m}\mathrm{p}\mathrm{r}\mathrm{o}\mathrm{p}\mathrm{e}\mathrm{r}} $ 表示二面角,$ {E}_{\mathrm{\phi },\mathrm{\psi },\mathrm{\chi }1} $ 表示旋转偏差);同时也包含了残基间远程相互作用,如$ {E}_{\mathrm{p}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{a}\mathrm{r}} $ 表示的极性库伦相互作用和$ {E}_{\mathrm{n}\mathrm{o}\mathrm{n}-\mathrm{p}\mathrm{o}\mathrm{l}\mathrm{a}\mathrm{r}} $ 表示的非极性范德华相互作用;此外,还囊括了$ {E}_{\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{W}-\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{W}} $ 表示的粗粒化水分子(CGW)之间,以及$ {E}_{\mathrm{C}\mathrm{G}\mathrm{W}-\mathrm{U}\mathrm{A}} $ 表示的水与残基之间的非共价相互作用。到目前为止,PACE粗粒化模型已被成功应用于对蛋白质折叠、多肽自组装、蛋白-多肽相互作用研究[19]。 -
本工作的所有模拟都基于GROMACS软件包(ver 2018.1)[20]来进行。在210 nm3的立方盒子内,先把GLP-1蛋白放置于中央,将40条五肽随机插入到盒子内,继续加入钠离子和氯离子使得体系整体呈电中性,并设置NaCl最终浓度为0.1 mol/L。盒子中充满水分子,且所有原子的运动符合周期性边界条件。
正式的分子模拟可分为3个阶段:能量最小化、热力学弛豫及成品模拟。在能量最小化阶段,利用最速下降法对模拟体系进行5000步的能量优化。在热力学弛豫阶段,将模拟体系温度从100 K缓慢升到310 K,模拟步长设置为2 fs,该过程持续500 ps,并对蛋白质进行位置限制,力常数设置为1000 kJ/nm,且体系体积保持不变。在成品模拟阶段,将体系放置在恒温恒压系综中进行模拟,系统温度和压力分别保持在310 K和1 bar,模拟步长为5 fs,该过程持续1000 ns。
在模拟运行过程中,每10步更新一次近邻列表,短程近邻列表的阈值为1.2 nm。非键范德华相互作用及长程静电相互作用的阈值为1.2 nm,相对介电常数设为15。利用Nose-Hoover方法及Parrinello-Rahman方法维持体系的温度和压力在设定值,耦合时间常数分别为1.0 ps和2.0 ps。
本研究中的4个模拟体系各进行了两次分子动力学模拟,总模拟时间超过8000 ns。
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成品模拟的最后200 ns的模拟被用来开展数据分析。利用VMD软件[21]的Timeline模块获得蛋白质二级结构的时间演化趋势;利用GROMACS的聚类函数获取模拟体系的典型构象,进一步使用PyMol软件[22]对构象进行渲染;利用GROMACS软件自带的分析模块获取体系的径向分布函数(RDF)、原子接触(atomic contact)、GLP-1蛋白的位置涨落(RMSF)、均方位移(MSD)及末端距(Distance)。GLP-1蛋白的末端距定义为N端α碳与C端α碳之间的距离。参考文献[19],当氨基N原子与羰基O原子之间距离小于0.32 nm时,定义为发生静电相互作用;当残基原子与和水原子之间的距离小于0.5 nm时,定义为发生了原子接触。
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已有研究显示,游离态的GLP-1蛋白不具有稳定的二级结构[23];而GLP-1蛋白与受体结合后,以长螺旋的形式存在[24]。在五肽存在的情况下,GLP-1蛋白空间构象如何变化,至今未有相关的实验研究。本研究中,GLP-1蛋白和五肽的初始构象分别被设定为α-螺旋和β-片层结构。由图1(a)可知,模拟开始后,游离GLP-1的构象变得非常不稳定,初始螺旋结构被分子热运行迅速破坏。由图1(b, c, d)可知,体系中引入40条五肽后,GLP-1蛋白的螺旋结构得以稳定;尤其在GLP@RE体系中,除两个末端外,GLP-1整体呈现长螺旋结构。
图 1 各模拟体系中GLP-1蛋白的二级结构随时间的变化情况
Figure 1. Time evaluation of the secondary structures for GLP-1 protein in different simulated systems
为定量观察体系的演化情况,本研究统计了混合体系中五肽与水的接触数。如图2(a)所示,接触数在前100 ns内快速下降,这说明五肽分子能够在短时间内调整空间分布。五肽与GLP-1的接触数(见图2(b))呈现出较大的涨落,但250 ns以后围绕平均值周期性变动,说明整个模拟体系基本到达热力学平衡态。在三个混合物体系中,GA-pep与水形成了最少的接触数,这说明GA-pep具有较强的疏水性,形成了较为致密的聚集体,同时与GLP-1蛋白形成了最多的接触数。KE-pep和RE-pep等两性离子多肽具有一定的亲水性,形成了的聚集体较为疏松;相较而言,KE-pep形成的聚集体最为疏松,与GLP-1蛋白形成了最少的接触数。
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模拟体系进入平衡态后,本研究进一步统计了GLP-1蛋白的末端距及二级结构分布。如图3所示,游离GLP-1蛋白的螺旋比例仅为30.8%,其末端距也最小(0.67 nm);而在得到五肽保护后,其螺旋比例明显提高。相比GA-pep,ZIPP更有利于GLP-1形成螺旋构象;特别是在GLP@KE体系中,螺旋比例增加到60.4%,近乎两倍于GLP@WAT体系。图4给出了GLP-1在不同体系中的典型构象。游离GLP-1蛋白的整体构象呈现为无规线团,N端与C端相互靠拢,呈闭环状,并形成少量β-片(见图1(a))。引入五肽后,GLP-1蛋白的两个末端被迫分开,增强了形成螺旋的概率;尤其是在GLP@RE体系中,GLP-1形成了单根长螺旋。而在GLP@GA和GLP@KE体系中,GLP-1蛋白形成了多个短螺旋。
图 3 热力学平衡后,各模拟体系中GLP-1蛋白的(a)二级结构分布及(b)末端距
Figure 3. Distribution of (a) secondary structures and (b) end-to-end distance of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium
图 4 热力学平衡后,各模拟体系中GLP-1蛋白的典型构象
Figure 4. Typical conformation of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium
综合图1及图3,GLP-1蛋白N端片段倾向于形成线团(coil)或转折(turn)等结构,而多肽片段Asp15-Val33是否形成螺旋则依赖于微环境。相关实验也发现了类似规律,如Thornton等人[25]发现十二烷基磷胆碱(DPC)胶束有助于GLP-1形成含有两个螺旋片段的构象,而Chang等人[26]发现三氟乙醇水溶液有助于GLP-1形成单个长螺旋构象。
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本研究利用径向分布函数(g(r))探讨了五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况(见图5(a))。GA-pep在形成致密聚集体的同时,也倾向于紧紧包围在GLP-1蛋白表面,因而在r = 0.5 nm附近呈现最高峰;KE-pep倾向于分散在水溶液中,从而远离GLP-1蛋白表面。图5(b)显示,五肽主要与GLP-1的10-12位残基和C端螺旋发生接触,而很少能接触到GLP-1蛋白的中间序列部分,这也说明五肽聚集体并没有完全把GLP-1蛋白包埋。
图 5 (a)五肽在GLP-1周围的径向分布情况;(b)GLP-1各个残基与多肽的原子接触情况
Figure 5. (a) Radial distribution functions (RDF) of around GLP-1; (b) Atomic contacts with pentapeptides for each residue of GLP-1
图6(a~c)给出了3个混合体系的模拟快照(snapshot),更直观地显示出五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况。GA-pep形成了较为致密的聚集体,只对GLP-1蛋白的两个末端形成了局部包覆,混合体系整体呈现左右结构;KE-pep形成的聚集体非常疏松,均匀分布在GLP-1蛋白周围,但是只与两个末端形成原子接触,混合体系整体呈现核壳结构;RE-pep聚集体介乎其间,更接近GA-pep情形,只与GLP-1蛋白两个末端形成原子接触。本研究还对五肽分子单独存在的溶液体系进行了粗粒化模拟。经过500 ns的热力学松弛,3种五肽分子在水溶液中呈现出了不同的聚集状态,如图6(e~f)所示。与混合体系模拟结果,可见3种五肽分子的不同聚集行为与是否引入GLP-1蛋白无关;换言之,五肽分子的内在特性决定了五肽与目标蛋白之间的相互作用模式。
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为继续探究五肽形成聚集体及包覆GLP-1蛋白的驱动力,本文统计了混合体系内的静电相互作用情况。由图7可见,KE-pep与GLP-1蛋白形成了最少的静电作用,同时KE-pep聚集体内部也形成最少的静电作用,这充分说明KE-pep具有最高的亲水性,倾向于均匀分散在水溶液中。RE-pep聚集体内部形成了最多的静电作用,但与GLP-1的静电作用稍微低于GLP@GA体系,这体现了驱动力的差异:RE-pep以静电作用作为形成聚集体的主要驱动力,而GA-pep同时利用静电及疏水作用形成致密聚集体,并以此与GLP-1形成最多的原子接触。相比游离GLP-1蛋白,与五肽混合后,其两个末端被迫分开,内部静电作用稍有减少。
图 7 各模拟体系中静电相互作用情况
Figure 7. The electrostatic interactions among GLP-1 protein and pentapeptides in different simulated systems
为了探究五肽中各残基对驱动力的贡献,本文进一步统计了各残基与GLP-1的原子接触数。如图8所示,GA-pep中Gly3和Ala4与GLP-1形成了最多的接触,而Val1和Pro2与GLP-1形成了最少的接触,这说明疏水性强的Val1和Pro2相互靠拢,驱动GA-pep形成致密聚集体;其C端朝外,与GLP-1蛋白形成接触。相比KE-pep,RE-pep的Val1和Arg3与GLP-1蛋白形成了最多的接触,且明显高于KE-pep对应的残基;这说明,RE-pep的Arg3不但有利于自身形成聚集体,也促进了其与GLP-1蛋白形成局部包覆。
图 8 各模拟体系中五肽各残基与GLP-1蛋白的原子接触数
Figure 8. Number of atomic contacts with GLP-1 for each residue of pentapeptide
相较GA-pep,两性离子多肽KE-pep和RE-pep都显示了亲水性。本文统计了水分子在ZIPP关键残基周围的径向分布函数。如图9所示,Glu4侧基氧原子周围的水分子密度基本相似,但Lys3侧基氮原子周围的水分子密度明显高于Arg3。这表明KE-pep喜欢分散在水环境中,而富含精氨酸的RE-pep更喜欢与其它残基形成静电作用。
图 9 水分子在两性离子多肽特定残基周围的径向分布:(a)赖氨酸及精氨酸侧基N原子周围的水分子分布;(b)谷氨酸侧基O原子周围的水分子分布
Figure 9. Radial distribution of water molecules around some spec residues of zwitterionic pentapeptides: (a) The distribution of water molecules around N atoms of the side groups of LYS and ARG; (b) The distribution of water molecules around the O atom of the side groups of GLU
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本研究使用两个序参量刻画GLP-1蛋白的动力学性质。图10显示,各残基在其位置附近的涨落明显受到了五肽的影响。引入五肽后,GLP-1蛋白序列的中间部分形成了螺旋结构,其位置涨落受到抑制;但其N末端相关残基的位置涨落变动更强烈,尤其是GLP@GA体系,这表明GA-pep聚集体与GLP-1蛋白N端的相互作用稍弱。
图 10 各模拟体系中GLP-1蛋白的动力学性质:(a)各残基的根均方的涨落情况;(b)GLP-1均方位移随时间变化情况
Figure 10. Kinetic properties of GLP-1 protein in different simulated system: (a) The root-mean-squared fluctuation (RMSF) of each residue;(b) The mean-squared displacement (MSD) of GLP-1 as functions time
水溶液中,GLP-1蛋白与五肽混合后,其扩散能力也必然受到影响。图10计算了不同模拟体系中GLP-1蛋白的均方位移。基于爱因斯坦扩散理论,游离GLP-1的扩散系数为0.13 nm2/ns,与GA-pep、KE-pep或RE-pep混合后,其扩散系数分别降低至0.036 nm2/ns、0.047 nm2/ns及0.014 nm2/ns。可见五肽聚集体明显阻碍了GLP-1在溶液中的扩散,尤其是RE-pep,其聚集体密度低于GA-pep,但最强烈地影响了GLP-1的扩散能力;相比而言,由KE-pep组成的松散外壳对GLP-1的扩散阻力最小。
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(1)游离GLP-1的两末端相互靠近,形成环状构象,螺旋比例仅为30%;而与五肽混合后,GLP-1两末端倾向于与五肽形成相互作用,中间片段形成较为规整的螺旋结构。
(2)两性离子五肽VPKEG具有较高的亲水性,倾向于均匀分散在水溶液中,在GLP-1周围形成疏松的保护层。两性离子五肽VPREG以静电作用为主,倾向于相互靠拢形成聚集体,也稳定了GLP-1的长螺旋结构。对照组VPGAG具有较高的疏水性,倾向于形成致密的聚集体,虽然与GLP-1形成了最多的原子接触,但未能充分包埋GLP-1并提供足够的保护。
(3)赖氨酸、谷氨酸组合让两性离子五肽VPKEG具备了恰当的亲疏水性和静电作用,既能维持GLP-1螺旋构象,也避免了被免疫蛋白识别,赋予其“隐身”特性。
两性离子多肽改善GLP-1生物活性的粗粒化分子模拟
Coarse-Grained Molecular Simulation of Zwitterionic Polypeptides on Improving the Bioactivity of Glucagon-Like Peptide-1(GLP-1)
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摘要: 以胰高血糖素样肽-1(GLP-1)与多肽的混合体系作为研究对象,利用粗粒化分子模拟对其作用模式进行研究。结果显示,3种混合体系都有利于GLP-1形成螺旋结构。其中,两性离子五肽VPKEG具有较强亲水性,在GLP-1周围形成疏松的保护层;而两性离子五肽VPREG与GLP-1形成较多静电作用;对照组五肽VPGAG具有较强疏水性,形成致密聚集体,未能给GLP-1提供足够保护。赖氨酸、谷氨酸组合让两性离子五肽VPKEG具备了恰当的亲疏水性和静电作用,既能维持GLP-1构象,也可避免被免疫蛋白识别,赋予其“隐身”特性。Abstract: Zwitterionic polypeptides (ZIPPs) have demonstrated great protection to protein drugs owing to their anti-fouling or “stealth” properties. ZIPPs endow the target protein with better pharmacokinetics than non-zwitterionic counterparts, while the microscopic mechanism is still unclear due to the complicated conformation space. As an alternative, the present work designed three pentapeptides, which share the ZIPP-repeat units VPX1X2G. Here, X1 and X2 are cationic and anionic amino acids, respectively. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1), an important drug for type-II diabetes, was selected as a research subject, which is mixed with different types of pentapeptides. The interaction mode and conformation space were explored using molecular simulation with coarse-grained PACE (Protein in Atomistic details coupled with Coarse-grained Environment) forcefield. Our molecular simulations revealed that the initially constructed α-helix was quickly destroyed by thermal fluctuation for isolated GLP-1. Finally, only thirty percent of helix was exit in the conformation of GLP-1 and the N- and C-terminus tended to contact each other to form short β-sheet. When mixing with pentapeptides, the percent of helical structure increased to about 60% for GLP-1, and the formation of two or one helical segment depended on the interaction mode between pentapeptide and GLP-1. Among them, the zwitterionic pentapeptide VPKEG with the strongest hydrophilicity preferred to be uniformly dispersed in solution, and thus formed a loose protective layer around GLP-1. Because of the arginine residue, the zwitterionic pentapeptide VPREG exerted the strongest electrostatic interaction to GLP-1, which was conducive to the highest helicity of GLP-1 but hardest to the diffusion process. In the control system, pentapeptide VPGAG with the strongest hydrophobicity formed the densest aggregate, but cannot fully enwrapped GLP-1 and provide sufficient protection yet. In short, the same content of lysine and glutamate endows zwitterionic pentapeptide VPKEG with proper hydrophobicity and electrostatic effect, which can not only maintain GLP-1 conformation but also avoid being recognized by immune protein, showing the "stealth" property. In contrast, the arginine residue in VPREG tended to form electrostatic interactions with other residues instead of water molecules, making it not so hydrophilic as VPKEG.
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Key words:
- glucagon-like peptide-1 /
- zwitterionic polypeptide /
- molecular simulation
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图 9 水分子在两性离子多肽特定残基周围的径向分布:(a)赖氨酸及精氨酸侧基N原子周围的水分子分布;(b)谷氨酸侧基O原子周围的水分子分布
Figure 9. Radial distribution of water molecules around some spec residues of zwitterionic pentapeptides: (a) The distribution of water molecules around N atoms of the side groups of LYS and ARG; (b) The distribution of water molecules around the O atom of the side groups of GLU
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