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锂藻土基可注射材料制备及其体外成骨分化

张泽人 李亚民 刘天舒 蒋佳 赵金忠 李玉林 刘昌胜

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锂藻土基可注射材料制备及其体外成骨分化

    作者简介: 张泽人(1993—),男,硕士,研究方向为生物医用材料。E-mail:unss163@163.com.
    通讯作者: 李玉林, yulinli@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R318.08

Development of Injectable Laponite-Based Materials with Promoted Osteogenic Differentiation Capacity

    Corresponding author: LI Yulin, yulinli@ecust.edu.cn ;
  • CLC number: R318.08

  • 摘要: 根据骨仿生原理,将具有类骨组成的羟基磷灰石(HAp)原位掺杂到具有成骨诱导活性的纳米盘结构锂藻土(LP)基体中,利用锂藻土良好的水溶液分散性及原位成胶能力,通过一步法简单快速地制备了一种具有触变性的高活性钙磷复合可注射生物材料。与纯锂藻土可注射材料(LIM)相比,锂藻土羟基磷灰石可注射复合材料(LHIM)中的羟基磷灰石分散均匀,羟基磷灰石的引入增大了锂藻土凝胶表面的粗糙度,提高了兔骨髓间充质干细胞在锂藻土凝胶表面的黏附、迁移、增殖以及成骨分化能力。
  • 图 FIG. 508.  FIG. 508.

    Figure FIG. 508..  FIG. 508.

    图 1  HAp的透射电镜图

    Figure 1.  TEM image of HAp

    图 2  LIM、HAp和LHIM的XRD图谱

    Figure 2.  XRD patterns of LIM、HAp and LHIM

    图 3  LIM、HAp和LHIM的FT-IR谱图

    Figure 3.  FT-IR spectra of LIM, HAp and LHIM

    图 4  LIM和LHIM的SEM图

    Figure 4.  SEM images of LIM and LHIM

    图 5  LHIM样品的EDS图谱

    Figure 5.  EDS spectra of LHIM

    图 6  LHIM的离子释放曲线

    Figure 6.  Ion release curves of LHIM

    图 7  rBMSCs在LIM和LHIM上培养1 d的SEM图

    Figure 7.  SEM images of rBMSCs cultured on LIM and LHIM after 1 d

    图 8  rBMSCs在LIM和LHIM上培养的死活染色结果

    Figure 8.  Live/ dead staining of rBMSCs cultured on LIM and LHIM

    图 9  LIM和LHIM对rBMSCs迁移能力的影响(t=1 d)

    Figure 9.  Effects of LIM and LHIM on migration of rBMSCs(t=1 d)

    图 10  LIM和LHIM分别与rBMSCs共培养7 d的ALP染色结果(普通细胞培养基)

    Figure 10.  ALP staining of rBMSCs cultured on LIM and LHIM after 7 d(Ordinary cell culture medium)

    图 11  LIM和LHIM分别与rBMSCs培养14 d后成骨标志物Runx2和OCN的免疫荧光染色结果

    Figure 11.  Immunofluorescence staining of the osteogenic marker Runx2 and OCN after rBMSCs cultured on LIM and LHIM for 14 d

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-01
  • 网络出版日期:  2020-12-03
  • 刊出日期:  2021-02-01

锂藻土基可注射材料制备及其体外成骨分化

    通讯作者: 李玉林, yulinli@ecust.edu.cn
    作者简介: 张泽人(1993—),男,硕士,研究方向为生物医用材料。E-mail:unss163@163.com
  • 1. 华东理工大学材料科学与工程学院,教育部医用生物材料工程研究中心,上海 200237
  • 2. 上海交通大学附属第六人民医院,上海 200233

摘要: 根据骨仿生原理,将具有类骨组成的羟基磷灰石(HAp)原位掺杂到具有成骨诱导活性的纳米盘结构锂藻土(LP)基体中,利用锂藻土良好的水溶液分散性及原位成胶能力,通过一步法简单快速地制备了一种具有触变性的高活性钙磷复合可注射生物材料。与纯锂藻土可注射材料(LIM)相比,锂藻土羟基磷灰石可注射复合材料(LHIM)中的羟基磷灰石分散均匀,羟基磷灰石的引入增大了锂藻土凝胶表面的粗糙度,提高了兔骨髓间充质干细胞在锂藻土凝胶表面的黏附、迁移、增殖以及成骨分化能力。

English Abstract

  • 近年来,交通事故及人口老龄化引起的骨科疾病日益增多,严重威胁人类身体健康和生活质量。人工骨具有安全、结构可设计和来源丰富等优点。其中,可注射人工骨材料可通过微创注射的方式植入不规则骨损伤处,降低手术的复杂性,减少病人的痛苦[1, 2],因而获得了广泛关注。然而,当前的可注射人工骨材料通常存在着制备工序复杂、组成复杂、骨修复活性较低和成骨能力差等缺点[3]。通过简单的组成和操作制备出高成骨活性的可注射人工骨材料,成为当前骨修复研究的热点和难点。

    众所周知,天然骨主要由I型胶原纤维有机相和羟基磷灰石(HAp)无机矿物相组成,作为天然骨的主要矿物相成分,HAp占整个骨组织的70%,天然骨中的HAp主要是由钙磷组成的六方晶系结晶体(长40~60 nm,宽20 nm,厚1.5~5 nm)。这些纳米棒镶嵌在I型胶原纤维之间,共同构成了骨的基本结构,天然骨有机无机相的独特组成和结构组装不但赋予了天然骨优异的强度和韧性,而且赋予了其强大的自我更新能力[4]。天然骨中HAp纳米棒通常具有不太完善的半晶结构,这种结构使其在维持较高强度的同时具有一定的生物可吸收性能,能及时地参与到骨整合和骨重塑的动态过程中。HAp可释放出钙磷等离子,利于促进成骨相关细胞的黏附、增殖或分化,同时其独特的纳米棒结构,能明显促进成骨诱导活性。因此,近年来人们研究了不同形状HAp的成骨性能,并制备了多种掺杂HAp的复合材料。Priya等[5]通过化学沉淀法制备了球形(长径比2.12)和稻米形(长径比3.19)两种不同形状的HAp,结果表明长径比2.12的HAp成骨活性更高。Kim等[6]以聚乳酸为基体,HAp作为纳米增强材料通过3D打印技术制备的复合纤维长丝,是一种潜在的骨修复材料。Ding等[7]制备了丝素蛋白/海藻酸钠/HAp复合可注射水凝胶,体外研究表明材料具有良好的细胞相容性和一定的成骨活性。然而,当前的HAp可注射材料制备过程较为复杂,且可注射性和可塑性不足[8]

    锂藻土(LP)作为一种合成的硅酸盐纳米材料,具有明确的化学组成和结构,可避免天然黏土中存在的杂质带来的毒副作用。当分散到水中后,LP会逐渐剥离成均匀分散的纳米盘状结构,纳米盘的直径为25 nm、厚度为0.92 nm,纳米盘边缘呈现正电性,中央带有负电荷。这一独特的电荷分布使LP能在水溶液中自组装形成触变性的凝胶材料,因而可作为可注射材料的理想候选。同时,LP具有生物降解性,可在降解过程中释放原硅酸和Mg2+、Li+,其中Li+有利于干细胞的增殖和成骨向分化[9],Mg2+有利于干细胞的矿物沉积和成骨向分化[10],原硅酸利于干细胞的迁移、黏附、铺展及成骨向分化[11]。Gaharwar等[12-14]研究表明在各种人工合成高分子材料中引入LP能够有效增加细胞的黏附和增殖,同时LP能够在无因子的情况下促成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Dawson和Gibbs等发现LP可有效吸附生物活性因子血管内皮生长因子(VEGF)[15]、骨成型蛋白2(BMP-2)[16],提高生物活性因子稳定性和生物活性。Nagahama等[17]发现LP能够强烈吸附生物活性蛋白和多糖类细胞外基质。Gaharwar等[18]利用LP自组装的特性制备了高质量浓度(90 mg/mL)LP黏性材料,巨噬细胞共培养结果表明LP没有明显的细胞毒性和趋炎作用。尽管如此,LP缺少钙磷成分且在体内缺乏足够的骨传导性[19]。目前很少有关于LP作为基体材料掺杂其他无机材料的研究,我们设想将具有良好骨诱导能力和可注射性的LP与具有良好骨传导性的钙磷材料相结合,开发出一种高活性可注射骨再生活性材料。

    基于此,本研究通过化学沉淀法合成了HAp纳米棒,并将其掺杂到LP分散液中,通过后者的分散黏性化特性发展了具有触变性的锂藻土羟基磷灰石复合可注射材料(LHIM),并与纯LP可注射材料(LIM)进行对比研究。通过Transwell实验研究材料对干细胞迁移活性的影响;用扫描电镜观察细胞在材料表面的黏附形态;通过碱性磷酸酶活性染色评估材料的成骨活性,最后通过免疫荧光染色法初步研究了材料成骨机理。结果表明,LP的存在可有效抑制HAp的团聚,形成的杂化可注射材料利于干细胞的迁移、黏附,有效促进干细胞的骨向定向分化。

    • 四水合硝酸钙(Ca(NO32·4H2O)、氨水(NH3·H2O)、氢氧化钠(NaOH)、无水乙醇、肝素、L-抗坏血酸、丙酮、氯化铵(NH4Cl):分析纯,上海泰坦化学试剂有限公司;磷酸氢二铵((NH42HPO4):分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;戊二醛:w=25%,上海麦克林生化科技有限公司;锂藻土(LP):分析纯,洛克伍德公司;磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS):分析纯,美国GBICO公司;3-[双(2-羟乙基)氨基]丙烷-三乙氧基硅烷:分析纯,上海西格玛奥德里奇贸易有限公司;透析袋:Mw=14×104,25 mm扁宽,上海源聚生物科技有限公司;新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs):上海交通大学附属第六人民医院提供;DMEM培养基、青霉素/链霉素双抗:分析纯,美国GE Healthcare HyClone公司;FITC-鬼笔环肽、Runx2抗体、骨钙蛋白(OCN)抗体、Alexa Fluor 488-羊抗兔IgG抗体、罗丹明标记鬼笔环肽、4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI):分析纯,美国Abcam公司;牛血清蛋白(BSA):分析纯,中国赛默飞世尔科技有限公司;HRP-羊抗兔IgG二抗:美国CST公司;聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X 100):北京索莱宝生物科技有限公司。

    • X射线衍射仪:瑞士梅特勒托利多国际股份有限公司AL104型,Cu靶,40 mA,40 kV,3(°)/min;傅里叶变换红外光谱仪:美国赛默飞世尔公司Nicolet 6700型,溴化钾压片,波长范围为4000~500 cm−1;等离子体发射光谱仪:美国PerkinElmer公司Agilent 725 ICP-OES型;激光共聚焦显微镜:日本尼康公司Zeiss LSM510型;透射电子显微镜:日本电子株式会社JEM-1400型;扫描电子显微镜:日本日立集团公司S-4800型;倒置显微镜:日本Nikon公司。

    • 首先分别配制400 mL 0.08 mol/L的Ca(NO32·4H2O水溶液和240 mL 0.048 mol/L的(NH42HPO4水溶液。之后滴加氨水调节(NH42 HPO4溶液的pH至10~12,并在强磁力搅拌条件下将Ca(NO32溶液快速倒入调好pH的(NH42HPO4溶液中,再次滴加氨水维持混合溶液的pH至10~12,在30 ℃下反应24 h。最后,真空抽滤反应溶液,并用超纯水和乙醇交替洗涤滤饼3~4次后冻干24 h得到纳米HAp颗粒。

    • 称取100 mg HAp分散于5 mL超纯水中,超声10 min至HAp充分分散形成乳白色悬浮液。将300 mg LP粉末与HAp悬浮液混合后剧烈震荡30 s,继续超声10 min至混合液失去流动性,最后将混合液置于37 ℃恒温恒湿箱24 h用以稳定体系,最终得到LHIM。

      作为对照组的LIM制备过程如下:将300 mg LP粉末与5 mL超纯水混合后剧烈震荡30 s,继续超声10 min至分散液失去流动性,最后将分散液置于37 ℃恒温恒湿箱24 h用以稳定体系,最终得到LIM。分别将LHIM和LIM冻干成粉末。采用X-射线衍射仪表征两种粉末的晶态和结构,傅里叶变换红外光谱仪表征两种粉末的官能团,带能谱仪的扫描电镜研究两种粉末的表面形态以及元素分布。

    • 在透析袋内加入1 mL PBS(pH=7.4)溶液和1 mL LHIM并放入装有9 mL PBS的15 mL离心管中,置于37 ℃恒温摇床(80 r/min)中进行缓释,分别在缓释的1、3、5、7、14 d对离心管内的PBS溶液进行收集和更新。用等离子体发射光谱仪对收集的溶液进行Ca、Mg、Li、Si元素含量分析。每组准备3个平行样进行实验。

    • 将可注射材料注射到12孔板底部,并均匀涂覆,向每个孔板中加入1 mL PBS溶液以保持材料湿润,紫外照射24 h对材料进行灭菌后将PBS吸出,之后在每个孔加入3万个细胞的rBMSCs悬液(体积分数1%青霉素链霉素双抗的DMEM培养基,体积分数10%的血清,1 mL),并在37 ℃,体积分数5%的CO2条件下培养,隔天换液。

    • 按照1.3.4的步骤接种细胞,材料与干细胞共培养24 h后将培养液吸出,用无血清的DMEM培养基缓慢漂洗以去除未黏附在材料表面的细胞,吸出培养基后以质量分数2.5%的戊二醛固定细胞20 min后,吸出戊二醛溶液,再用PBS清洗以彻底去除残留的戊二醛溶液,之后依次用质量分数25%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度乙醇溶液进行脱水处理,每个浓度乙醇脱水5 min,最后在37 ℃烘箱中干燥24 h,以扫描电镜对细胞黏附形态进行观察。

    • 通过死活染色观察LIM以及LHIM材料上的死细胞和活细胞数量来分析其细胞相容性。按照 1.3.4的步骤接种细胞,材料与细胞共培养1、3、7 d后,吸走培养基,依次加入适量的由1 mL FITC(5 mg/mL,溶剂为丙酮)和1 μL PI(5 mg/mL,溶剂为PBS)配制的染色工作液,25 ℃避光染色15 min后用PBS进行漂洗,通过荧光倒置显微镜观察结果,用Image J软件进行半定量分析。

    • 采用膜孔径为8 μm的聚碳酸酯膜Transwell 12孔板研究LIM和LHIM对rBMSCs迁移能力的影响。具体实验步骤如下:使用无血清培养基对细胞进行24 h的饥饿处理。在细胞重悬液体内加入2%(体积分数) FBS,将细胞接种至Transwell的上室(每个孔加入500 μL,细胞密度为每孔105个)。在下室加入LIM或LHIM。培养24 h后,移去上室内的培养基,用棉签将上室细胞擦去,使用显微镜观察结果,用Image J软件进行半定量分析。

    • 碱性磷酸酶(ALP)染色的实验步骤:将可注射材料均匀铺在12孔板底部,向每个孔板中加入1 mL PBS溶液保持材料湿润,紫外照射24 h灭菌后将PBS吸出,rBMSCs接种密度为每孔3×104个,在普通培养基,37 ℃,体积分数5%的CO2条件下培养7 d后移去培养基,每个孔板用PBS冲洗2次以洗去多余的培养基,使用质量浓度40 g/L的多聚甲醛溶液于室温下固定15 min,用PBS清洗3次以洗去多余的多聚甲醛,加入四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(NBT/BCIP)染液,室温下孵育12 h,用PBS清洗3次以洗去多余染液,在室温下干燥后拍照观察,用Image J软件进行半定量分析。

    • 采用免疫荧光法进一步研究LIM和LHIM对rBMSCs的成骨诱导活性。将适量可注射材料与普通培养基在37 ℃条件下混合4 d,离心分离培养液获得LIM材料和LHIM材料萃取培养液。将rBMSCs(每孔3万个细胞)在材料萃取培养液条件下孵育14 d后,用体积分数4%的多聚甲醛进行固定细胞,之后以体积分数0.1%的Triton-X 100在室温条件下透膜10 min,并以1%的BSA溶液封闭抗原30 min。在4 ℃下将细胞与500倍稀释的OCN抗体和Runx2抗体溶液孵育过夜。对OCN和Runx抗体进行回收,再以PBS反复仔细清洗3次,在孔板中加入上述两抗体(500 μL、10 μg/L,Alexa Fluor 488标记)在室温下对Runx2和OCN染色2 h。移去培养基,用PBS反复仔细清洗5次,进一步用罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞肌动蛋白30 min,DAPI染色细胞核15 min,以PBS反复仔细清洗3次。倒置荧光显微镜下观察,用Image J软件进行半定量分析。

    • 本文中的数值数据均以平均值±标准偏差表示。统计分析采用单因素方差分析,在p<0.05时被认为具有显著性差异。

    • 图1为所合成HAp的透射电镜图。HAp颗粒呈长25~35 nm,宽10~20 nm的纳米棒状结构。图2为各样品的X射线衍射图。LHIM除了有HAp的特征衍射峰外,在2θ=28.1°和2θ=17.6°还有LP水化后特有的衍射峰。图3为各样品的红外光谱图。LHIM在3440 cm−1处的吸收峰为羟基的伸缩振动峰,1032 cm−1处为磷酸根的伸缩振动吸收峰,563 cm−1和602 cm−1处是磷酸根的变形振动峰,1300~1000 cm−1处宽而强的吸收峰来自于LP的Si―O―Si键。以上结果均表明了LHIM材料的成功制备。

      图  1  HAp的透射电镜图

      Figure 1.  TEM image of HAp

      图  2  LIM、HAp和LHIM的XRD图谱

      Figure 2.  XRD patterns of LIM、HAp and LHIM

      图  3  LIM、HAp和LHIM的FT-IR谱图

      Figure 3.  FT-IR spectra of LIM, HAp and LHIM

      图4为各样品的扫描电镜图。结果表明LIM表面十分平整,而LHIM表面有明显的矿化结构。进一步对LIM和LHIM的X射线能谱结果进行分析,图5表明LHIM中的Mg、Si、Ca和P元素分布十分均匀,其中Si和Mg元素均为LP所含元素,Si、Mg元素分布均匀表明LP在材料中无明显团聚。Ca和P元素均为HAp中元素,Ca和P元素分布均匀表明HAp在材料中无明显团聚。因此,扫描电镜和X射线能谱的结果表明由于HAp的引入,LHIM表面呈明显的矿化结构且HAp和LP在复合材料中均匀分散无明显团聚。

      图  4  LIM和LHIM的SEM图

      Figure 4.  SEM images of LIM and LHIM

      图  5  LHIM样品的EDS图谱

      Figure 5.  EDS spectra of LHIM

    • 图6为LHIM在体外的离子释放曲线。结果表明,LHIM可以释放出Ca2+、Mg2+等利于成骨的离子,在5 d以后各种离子的释放速率开始趋于平稳并达到平衡。其中Si是LP纳米盘的骨架结构,Si的大量释放意味着材料骨架结构的破坏与降解。

      图  6  LHIM的离子释放曲线

      Figure 6.  Ion release curves of LHIM

    • 图7为rBMSCs在材料表面的黏附图。结果表明,rBMSCs能在LIM和LHIM材料表面黏附,而且LHIM材料表面细胞黏附的形态更好,表明LHIM材料的细胞相容性更好,这可能是由于LHIM表面较为粗糙更利于细胞黏附。图8细胞死活染色分析结果显示,rBMSCs在LIM和LHIM材料表面均生长良好,表明两种材料均能够支持细胞的生长,且1 d时LHIM材料表面细胞更多更密集。以上结果说明LIM和LHIM材料均具有良好的细胞相容性。

      图  7  rBMSCs在LIM和LHIM上培养1 d的SEM图

      Figure 7.  SEM images of rBMSCs cultured on LIM and LHIM after 1 d

      图  8  rBMSCs在LIM和LHIM上培养的死活染色结果

      Figure 8.  Live/ dead staining of rBMSCs cultured on LIM and LHIM

    • 图9为rBMSCs的Transwell实验结果。结果显示LIM和LHIM均能提高干细胞的迁移能力,且LHIM提高干细胞的迁移能力更强,可能的原因是由于LHIM中的HAp能释放钙离子,从而进一步提高了干细胞的迁移能力。

      图  9  LIM和LHIM对rBMSCs迁移能力的影响(t=1 d)

      Figure 9.  Effects of LIM and LHIM on migration of rBMSCs(t=1 d)

    • ALP染色结果及半定量分析结果如图10所示。与rBMSCs共培养7 d后,LIM和LHIM复合材料表面均有大量的ALP生成,表明两种材料均能在无因子的情况下诱导刺激干细胞向成骨细胞分化,且LHIM表面干细胞产生的ALP更多,从而证明LHIM复合材料相比LIM具有更强的骨诱导能力。

      图  10  LIM和LHIM分别与rBMSCs共培养7 d的ALP染色结果(普通细胞培养基)

      Figure 10.  ALP staining of rBMSCs cultured on LIM and LHIM after 7 d(Ordinary cell culture medium)

      图11为OCN和Runx2蛋白染色结果,结果显示LIM和LHIM材料表面的rBMSCs均能很好地铺展开,表明两种材料均具有良好的细胞相容性。进一步分析两种OCN和Runx2蛋白表达。Runx2蛋白在成骨细胞分化的多种信号途径中起中心作用,在成骨前期过程中起到了关键性的作用。从图11(a)中可见,14 d后LIM和LHIM材料表面干细胞均有明显的Runx2蛋白免疫荧光,且LHIM表面细胞的Runx2蛋白免疫荧光强度更强,表明LHIM材料更能刺激干细胞分泌Runx2蛋白;OCN是一种由成骨细胞分泌的蛋白,在调节骨钙代谢中起重要作用。从图11(b)可见,LHIM材料表面细胞的OCN蛋白免疫荧光强度明显高于LIM材料的相似值,表明LHIM材料更能刺激干细胞分泌OCN蛋白。以上结果均表明LHIM比LIM更能刺激干细胞分泌Runx2和OCN,LHIM具有更强的骨诱导能力。

      图  11  LIM和LHIM分别与rBMSCs培养14 d后成骨标志物Runx2和OCN的免疫荧光染色结果

      Figure 11.  Immunofluorescence staining of the osteogenic marker Runx2 and OCN after rBMSCs cultured on LIM and LHIM for 14 d

    • (1)合成了长25~35 nm,宽10~20 nm的棒状纳米级的HAp。

      (2)制备了具有触变性的LHIM,HAp的引入显著增加了材料的粗糙度,纳米HAp可在材料中均匀分布。

      (3)LHIM和LIM均具有良好的细胞相容性,LHIM比LIM更能促进干细胞的黏附、迁移以及成骨分化。

参考文献 (19)

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