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  • ISSN 1008-9357
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原花青素增强的聚乙二醇-溶菌酶生物活性水凝胶敷料的构筑及性能

陈占祎 谈浩琪 屈雪

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原花青素增强的聚乙二醇-溶菌酶生物活性水凝胶敷料的构筑及性能

    作者简介: 陈占祎(1994—),女,河南郑州人,硕士生,主要研究方向为生物医用高分子材料。E-mail:849461900@qq.com.
    通讯作者: 屈雪, quxue@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R318.08

Fabrication and Performance of Proanthocyanidin Enhanced PEG-Lysozyme Bioactive Hydrogel Dressing

    Corresponding author: QU Xue, quxue@ecust.edu.cn
  • CLC number: R318.08

  • 摘要: 以聚乙二醇(PEG)-溶菌酶(LZM)水凝胶(PEG-LZM)为模型,通过后浸泡法复合原花青素(PC)获得原花青素增强的聚乙二醇-溶菌酶水凝胶(PEG-LZM-PC)。通过扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪和电子万能试验机考察了PEG-LZM-PC的形貌、结构和力学性能,通过平板涂布法评估了PEG-LZM-PC的抗菌能力,通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测了PEG-LZM-PC对免疫细胞炎症因子表达的影响。结果表明:PEG-LZM-PC的强度和韧性相比于PEG-LZM有较大提升,且具有良好的体内外抗菌性能,并且可以抑制由脂多糖刺激引起的炎症反应,有望促进伤口愈合。
  • 图 FIG. 507.  FIG. 507.

    Figure FIG. 507..  FIG. 507.

    图 1  水凝胶的宏观形貌(a)及扫描电镜图(b);样品的红外光谱图(c)

    Figure 1.  Visual images (a) and SEM images (b) of hydrogel; FT-IR spectra (c) of samples

    图 2  水凝胶的含水量及原花青素含量

    Figure 2.  Water content and proanthocyanidin content of hydrogel

    图 3  样品对S.aureus(a)、E.coil(b)的抗菌动力学曲线;S.aureus(c)、E.coil(d)与样品共培养12 h后形成的菌落照片

    Figure 3.  Antibacterial kinetics curves of samples against S. aureus (a) and E. coli (b), respectively; Photos of bacterial colonies formed by S. aureus (c) and E. coli (d) after exposure to samples for 12 h, respectively

    图 4  3M敷料、PEG-LZM水凝胶和PEG-LZM-PC-12 h水凝胶处理的伤口照片(a)、伤口渗出液涂板照片(b)及伤口渗出液在600 nm处的吸光度(c)

    Figure 4.  Photos of wound (a), photos of colonies (b) and OD 600 nm value of wound exudate treated with 3M dressing, PEG-LZM hydrogel and PEG-LZM-PC-12 h hydrogel, respectively(c)

    表 1  水凝胶的拉伸断裂伸长率和拉伸断裂强度

    Table 1.  Tensile elongation at break and tensile stress at break of hydrogel

    SampleTensile elongation at break/%Tensile stress at break/MPa
    PEG-LZM31.4 ± 4.10.013 ± 0.005
    PEG-LZM-PC-12 h103.4 ± 8.8 ***0.044 ± 0.035
    PEG-LZM-PC-24 h194.9 ± 80.2 ***0.153 ± 0.026 **
    PEG-LZM-PC-48 h260.9 ± 8.4 ***0.190 ± 0.047 **
    ** Represents p<0.01, vs PEG-LZM; *** Represents p<0.001, vs PEG-LZM
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    表 2  LPS刺激的人单核巨噬细胞THP-1暴露于样品后炎症因子的表达

    Table 2.  Expression levels of inflammatory genes of LPS-stimulated human mononuclear macrophages THP-1 after exposure to samples

    mRNA(fold of change)IL-10IL-13p65HIF-1α
    Culture plate13.130 ± 2.3641.368 ± 0.6684.893 ± 0.2044.103 ± 0.748
    PEG-LZM20.501 ± 1.987**5.648 ± 0.421***1.031 ± 0.107***1.452 ± 0.491**
    PEG-LZM-PC-12 h25.833 ± 5.574**12.210 ± 1.482***##0.610 ± 0.017***##1.025 ± 0.123***
    ** Represents p<0.01, *** Represents p<0.001, vs culture plate; ## Represents p<0.01, vs PEG-LZM
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-06-24
  • 网络出版日期:  2020-10-27
  • 刊出日期:  2021-02-01

原花青素增强的聚乙二醇-溶菌酶生物活性水凝胶敷料的构筑及性能

    通讯作者: 屈雪, quxue@ecust.edu.cn
    作者简介: 陈占祎(1994—),女,河南郑州人,硕士生,主要研究方向为生物医用高分子材料。E-mail:849461900@qq.com
  • 华东理工大学材料科学与工程学院,教育部医用生物材料工程研究中心,上海 200237

摘要: 以聚乙二醇(PEG)-溶菌酶(LZM)水凝胶(PEG-LZM)为模型,通过后浸泡法复合原花青素(PC)获得原花青素增强的聚乙二醇-溶菌酶水凝胶(PEG-LZM-PC)。通过扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪和电子万能试验机考察了PEG-LZM-PC的形貌、结构和力学性能,通过平板涂布法评估了PEG-LZM-PC的抗菌能力,通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测了PEG-LZM-PC对免疫细胞炎症因子表达的影响。结果表明:PEG-LZM-PC的强度和韧性相比于PEG-LZM有较大提升,且具有良好的体内外抗菌性能,并且可以抑制由脂多糖刺激引起的炎症反应,有望促进伤口愈合。

English Abstract

  • 水凝胶临床应用广泛[1, 2],作为伤口敷料使用,不仅有助于吸收伤口渗出液,而且在水凝胶的湿润环境下,创面内细胞、蛋白酶及各类促生长因子的活性增强,有利于伤口愈合[3]。然而多数水凝胶内部为共价键连接,缺乏应力耗散能力,在高动态压力情况下容易发生脆性断裂,大大限制了其应用可靠性。为改善水凝胶的力学性能,人们提出了多种改性方法,比如,将聚乙烯醇水凝胶与无机黏土复合形成纳米复合材料[4],在明胶-藻酸盐半互穿网络中添加钙离子构建互穿网络水凝胶[5],用硝酸铈铵引发自由基聚合对葡甘露聚糖进行接枝,再与聚(N-乙烯基吡咯烷酮)复合构建接枝共网络水凝胶[6]等。尽管这些方法能有效改善水凝胶力学性能,但上述改性方法相对复杂,重复性差。

    目前伤口敷料主要通过复合抗生素或Ag系纳米材料抗菌,容易引起细菌耐药性或远期生物安全性问题。再者,伤口处感染容易形成慢性伤口,持续感染又会刺激免疫细胞的不断涌入,加剧炎症循环。因此,理想的伤口敷料应具备特定的抗菌和抗炎生物活性。

    天然植物多酚原花青素(PC)分子骨架上含有丰富的苯环和羟基基团,可以与聚乙二醇、蛋白等建立基于氢键[7-9]、疏水作用[10]等相互作用,常用于增强胶原基生物材料的力学性能。此外,PC具有优异的抗菌性以及良好的抗炎特性,可以通过清除自由基保护组织免受炎症损伤,在抗龋齿[11]、改善视觉功能[12]等方面已有广泛应用。

    本课题组之前报道过利用末端修饰琥珀酰亚胺的四臂聚乙二醇(PEG)的活性酯基团与溶菌酶(LZM)蛋白上的氨基基团通过酰胺化反应,原位制备聚乙二醇-溶菌酶(PEG-LZM)水凝胶[13]。该水凝胶具有可注射、促细胞黏附和抗溶胀等优异特性,以及作为创面敷料的潜在优势。但其力学性能相对较差,且生物活性不足。由于PEG-LZM水凝胶中的醚键和溶菌酶的疏水域可以作为非共价键作用位点,本文通过后浸泡法将PC引入到水凝胶中并自发与原PEG-LZM网络通过氢键等相互作用形成PEG-LZM-PC,一方面使材料的力学性能得到增强,另一方面,PC的引入增强了材料的生物活性,使得水凝胶的抗菌及抗炎性能得到了显著提升,从而可以更好地发挥水凝胶作为新型创面敷料在保护创面和促进伤口愈合方面的作用。

    • PC:分析纯,上海麦克林生化试剂有限公司;LZM:超纯,北京索莱宝科技有限公司;PEG:Mn=1.0×104,厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司;营养肉汤、营养琼脂、胰酪胨大豆肉汤培养基、胰酪大豆胨琼脂:分析纯,上海博微生物科技有限公司;胎牛血清、胰酶、RPMI-1640培养基:生化级,美国Gibco公司;脂多糖(LPS)、核转录因子亚基(p65)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-13(IL-13)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH):生化级,美国Sigma-Aldrich公司。

    • 采用日本日立公司S-3400型扫描电子显微镜(SEM)观察样品表面形貌,测试前对样品进行喷金处理;采用美国热电公司Nicolet is 50型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)分析样品组成,扫描波数范围为4 000~400 cm−1;采用宁波新芝生物科技股份有限公司Scientz-10N型冷冻干燥机对样品进行冻干处理;采用美特斯工业系统(中国)有限公司CMT2503型万能力学测试仪对样品进行拉伸测试(50 mm/min),试样尺寸为40 mm×10 mm×1 mm;采用美国Molecular Devices公司SPECTRA max 384型酶标仪检测菌液吸光度。

    • 分别称取等量LZM和PEG粉末,用0.1 mol/L磷酸缓冲液分别溶解至质量浓度为45 mg/mL的溶液,混合均匀后注入自制膜状模具中形成PEG-LZM水凝胶。将反应完全的水凝胶脱模后冻干。再用超纯水配制50 mg/mL的PC溶液,将冻干的PEG-LZM浸泡在配制好的PC溶液中,分别于12、24、48 h后取出,用流水冲洗掉表面未吸附的PC即得到PEG-LZM-PC水凝胶,记为PEG-LZM-PC-xx代表浸泡时间。将冻干后的PEG-LZM水凝胶裁剪成直径10 mm的圆片,称重记为ma;在PC溶液中分别浸泡12、24、48 h后吸去表面水分,称重记为mb;冷冻干燥后,再次称重记为mc。样品的含水量(w(H2O))及PC含量(w(PC))按公式(1)和公式(2)计算(n=5)。

      $ w\left( {{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{O}}} \right) = \left( {{m_{\rm b}} - {m_{\rm c}}} \right)/{m_{\rm b}} \times 100{\text%} $

      $ w\left( {{\rm{PC}}} \right) = \left( {{m_{\rm c}} - {m_{\rm a}}} \right)/{m_{\rm b}} \times 100{\text%} $

    • 体外抗菌性能:将大肠杆菌E. coli(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌S. aureus(ATCC 25923)作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌模型。取对数生长期的细菌用体积分数为50%的细菌培养基梯度稀释至1×105 CFU/mL,每孔加入1 mL菌液和直径15 mm的PEG-LZM-PC-12 h水凝胶膜或PEG-LZM水凝胶膜,以只加入1 mL菌液的样品作为空白对照,放入37 ℃恒温震荡箱共培养,每隔2 h取样测其在600 nm吸光度(OD),并在培养12 h后用生理盐水梯度稀释后涂板。

      体内抗菌性能:实验按照美国国立卫生研究院实验动物饲养管理和使用指南进行。首先,将35~42 d的雄性SD(Spraque-Dawley)大鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)随机分为3组(n=4):商用敷料组(医用纱布),PEG-LZM组以及PEG-LZM-PC-12 h组。用异氟烷麻醉大鼠,在其背部两边各建立一个直径为8 mm的圆形伤口,滴S. aureus(10 μL,1×107 CFU/mL)至材料上,待菌液风干后将材料分别覆盖在伤口上。术后第3 d用棉棒蘸取伤口部位渗出液读取菌液在600 nm处的OD值并稀释10 000倍后涂板。

    • 制备直径15 mm的无菌PEG-LZM、PEG-LZM-PC-12 h水凝胶膜于24孔板中,以细胞培养板作为空白对照。以每孔1×106个细胞的细胞密度接种人单核巨噬细胞THP-1(ATCC TIB-202),24 h后用1 μg/mL脂多糖刺激2 h,通过实时定量聚合酶链反应核酸扩增(PCR)仪(美国Bio-Rad公司CFX96型)检测各组细胞炎症因子p65、HIF-1α、IL-10、IL-13的表达,以GAPDH为内参(n=3)。

    • 数据以平均值±标准差表示,采用单因素方差(ANOVA)分析比较统计学差异。p<0.05表示结果具有统计学意义。

    • 图1为PEG-LZM-PC水凝胶在制备过程中的宏观/微观形貌及红外光谱图。如图1(a)所示,PEG-LZM水凝胶冻干之后为白色,而PEG-LZM-PC-12 h水凝胶呈现PC的红色,说明PC被引入到材料的基体之中。如图1(b)所示,PEG-LZM水凝胶为多孔结构,而PC进入PEG-LZM后,与LZM和PEG形成了氢键、疏水相互作用,增大了交联密度,使水凝胶的孔隙缩小,结构更加致密。图1(c)所示为PC及PEG-LZM浸泡PC前后水凝胶的红外光谱图。PC在1 445 cm−1处的C―O―H弯曲振动峰以及1 520 cm−1处的苯环C=C伸缩振动峰均出现在了PEG-LZM-PC-12 h水凝胶的红外光谱中,证明了PC的成功引入。同时,与PEG-LZM相比,PEG-LZM-PC-12 h的―OH伸缩振动峰变宽并向低波数移动,说明出现了大量分子间氢键。

      图  1  水凝胶的宏观形貌(a)及扫描电镜图(b);样品的红外光谱图(c)

      Figure 1.  Visual images (a) and SEM images (b) of hydrogel; FT-IR spectra (c) of samples

    • 图2所示为浸泡于PC溶液不同时间PEG-LZM-PC水凝胶的含水量及原花青素含量。表1所示为浸泡于PC溶液不同时间PEG-LZM-PC水凝胶的拉伸断裂伸长率和断裂强度。随着PC浸泡时间的延长,水凝胶的含水量减少,原花青素含量、断裂伸长率和断裂强度显著增加。说明随着浸泡时间的延长,PC逐渐进入到凝胶网络内部,使其交联密度增大,从而可通过浸泡时间的调整控制水凝胶的力学强度。

      SampleTensile elongation at break/%Tensile stress at break/MPa
      PEG-LZM31.4 ± 4.10.013 ± 0.005
      PEG-LZM-PC-12 h103.4 ± 8.8 ***0.044 ± 0.035
      PEG-LZM-PC-24 h194.9 ± 80.2 ***0.153 ± 0.026 **
      PEG-LZM-PC-48 h260.9 ± 8.4 ***0.190 ± 0.047 **
      ** Represents p<0.01, vs PEG-LZM; *** Represents p<0.001, vs PEG-LZM

      表 1  水凝胶的拉伸断裂伸长率和拉伸断裂强度

      Table 1.  Tensile elongation at break and tensile stress at break of hydrogel

      图  2  水凝胶的含水量及原花青素含量

      Figure 2.  Water content and proanthocyanidin content of hydrogel

    • 图3为PEG-LZM-PC-12 h水凝胶的体外抗菌性能评价。如图3(a,b)所示,空白组及未经PC交联的水凝胶组有明显的细菌增殖,而经过原花青素交联的水凝胶组S. aureus几乎不增殖,E. coli增殖较慢。图3(c,d)为两种细菌分别与材料共培养12 h后的涂板照片。可以看出,相对于对照组,细菌与PEG-LZM-PC-12 h水凝胶共培养后菌落数明显减少,说明PEG-LZM-PC-12 h水凝胶具有显著的抗菌效果,对S. aureus的抑制效果优于E. coli。这可能是由于S. aureus属于革兰氏阳性菌,其细胞壁结构较为简单,含大量肽聚糖,而E. coli为革兰氏阴性菌,其中的肽聚糖被携带负电荷的脂多糖外膜所覆盖,因此对革兰氏阴性菌抗菌效果稍弱。

      图  3  样品对S.aureus(a)、E.coil(b)的抗菌动力学曲线;S.aureus(c)、E.coil(d)与样品共培养12 h后形成的菌落照片

      Figure 3.  Antibacterial kinetics curves of samples against S. aureus (a) and E. coli (b), respectively; Photos of bacterial colonies formed by S. aureus (c) and E. coli (d) after exposure to samples for 12 h, respectively

      图4为PEG-LZM-PC-12 h水凝胶的体内抗菌性能评价。如图4(a)所示,商用敷料(3M)组伤口处化脓现象较为严重,PEG-LZM-PC-12 h组伤口表现正常。图4(b)是伤口渗出液稀释涂板照片,相比于3M敷料组和PEG-LZM水凝胶组,PEG-LZM-PC-12 h水凝胶组细菌数量较少。图4(c)是菌液在600 nm处的吸光度。结果显示相比于3M敷料组和PEG-LZM水凝胶组,PEG-LZM-PC-12 h水凝胶组菌液浓度显著降低,说明PEG-LZM-PC-12 h水凝胶具有一定的体内抗菌性能。

      图  4  3M敷料、PEG-LZM水凝胶和PEG-LZM-PC-12 h水凝胶处理的伤口照片(a)、伤口渗出液涂板照片(b)及伤口渗出液在600 nm处的吸光度(c)

      Figure 4.  Photos of wound (a), photos of colonies (b) and OD 600 nm value of wound exudate treated with 3M dressing, PEG-LZM hydrogel and PEG-LZM-PC-12 h hydrogel, respectively(c)

      以上结果表明,相比于3M敷料组和PEG-LZM组,PEG-LZM-PC-12 h组水凝胶可以降低伤口处细菌感染程度,有望作为新型活性水凝胶敷料在临床伤口管理领域进行应用。

    • 表2所示为THP-1细胞IL-10、IL-13、p65和HIF-1α的相对表达量,IL-10、IL-13为抗炎性因子,p65、HIF-1α为促炎性因子。与细胞培养板相比,PEG-LZM水凝胶和PEG-LZM-PC-12 h水凝胶均表达出了相对较高水平的抗炎基因和相对较低水平的促炎基因,推测与水凝胶中溶菌酶的生物活性[14]和PC的抗炎活性有关,且PEG-LZM-PC-12 h水凝胶抗炎基因表达最高、促炎基因表达最低,说明PEG-LZM-PC-12 h水凝胶具有良好的抑制炎症的效果。

      mRNA(fold of change)IL-10IL-13p65HIF-1α
      Culture plate13.130 ± 2.3641.368 ± 0.6684.893 ± 0.2044.103 ± 0.748
      PEG-LZM20.501 ± 1.987**5.648 ± 0.421***1.031 ± 0.107***1.452 ± 0.491**
      PEG-LZM-PC-12 h25.833 ± 5.574**12.210 ± 1.482***##0.610 ± 0.017***##1.025 ± 0.123***
      ** Represents p<0.01, *** Represents p<0.001, vs culture plate; ## Represents p<0.01, vs PEG-LZM

      表 2  LPS刺激的人单核巨噬细胞THP-1暴露于样品后炎症因子的表达

      Table 2.  Expression levels of inflammatory genes of LPS-stimulated human mononuclear macrophages THP-1 after exposure to samples

    • (1)PC能与PEG-LZM聚合物网络形成分子间氢键等相互作用,相比于PEG-LZM水凝胶,PEG-LZM-PC水凝胶的力学性能明显提高。

      (2)PEG-LZM-PC水凝胶具有良好的抗菌、抗炎效果,有望促进伤口的愈合。

参考文献 (14)

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