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聚醚醚酮/介孔硅酸钙镁复合材料表面周期性微沟槽对细胞行为的影响

韩航 RAMESKaewmanee SYEDAsadullah 沈学宁 潘永康 钱军 王雪红 魏杰

引用本文:
Citation:

聚醚醚酮/介孔硅酸钙镁复合材料表面周期性微沟槽对细胞行为的影响

    作者简介: 韩 航(1993-),女,山西文水人,硕士生,主要研究方向为生物医用材料。E-mail:2294268435@qq.com.
    通讯作者: 王雪红, wxhsnow@ecust.edu.cn ; 魏杰, jiewei7860@sina.com
  • 中图分类号: TB332

Effects of Periodic Micro-grooves on Surface of Polyetheretherketone/Mesoporous Calcium Magnesium Silicate Composite on Cell Behaviors

    Corresponding author: WANG Xuehong, wxhsnow@ecust.edu.cn ;WEI Jie, jiewei7860@sina.com
  • CLC number: TB332

  • 摘要: 采用飞秒激光在聚醚醚酮/介孔硅酸钙镁复合材料表面构建了不同宽度(20、40 μm和60 μm)的周期性微沟槽,考察了微沟槽宽度对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、增殖与分化的影响。结果表明:飞秒激光在复合材料表面构建不同宽度的周期性微沟槽可以调控细胞的行为。经过飞秒激光精确而超快烧蚀,微沟槽的内表面形成了微纳结构,暴露出大量的介孔硅酸钙镁颗粒,其内表面粗糙度明显提高;随着微沟槽宽度的增加,复合材料表面的蛋白质吸附性能提高,而且明显促进了大鼠骨髓间充质干细胞响应;当微沟槽宽度为60 μm时,复合材料表面显著地促进了细胞黏附、增殖与成骨分化,并且诱导细胞沿着沟槽方向生长。
  • 图 1  m-MCS、PEEK、PM和PM60的FT-IR谱图

    Figure 1.  FT-IR spectra of m-MCS、PEEK、PM and PM60

    图 2  PM20(a)、PM40(b)和PM60(c)的激光共聚焦3D显微镜照片,(d)为(c)中白色箭头所指区域的粗糙度(*代表p < 0.05)

    Figure 2.  Laser confocal 3D micrographs of PM20 (a), PM40 (b) and PM60 (c), and surface roughness (d) of the area indicated by the white arrow in (c) (* represents p < 0.05)

    图 3  PM20(a)、PM40(b)和PM60(c, d)表面微观形貌的SEM照片

    Figure 3.  SEM photographs of PM20 (a), PM40 (b) and PM60 (c, d)

    图 4  (a)样品在BSA溶液中浸泡24 h后的蛋白吸附量;(b)rBMSCs在样品表面培养不同时间的细胞黏附情况

    Figure 4.  (a) BSA protein adsorption on samples after soaking in bovine serum albumin solution for 24 h; (b) rBMSCs adhesion on the samples after cultivated for different time

    图 5  rBMSCs在PM(a)、PM20(b)、PM40(c)和PM60(d)表面培养后的细胞形态的激光共聚焦照片

    Figure 5.  Laser confocal photographs of cell morphology of rBMSCs cultivated on the surface of PM(a), PM20 (b), PM40 (c) and PM60 (d)

    图 6  rBMSCs在样品表面培养不同时间后的细胞增殖情况(a)和ALP活性(b)

    Figure 6.  Cell proliferation (a) and ALP activity (b) after rBMSCs cultivated on the surface of samples for different time

  • [1] KURTZ S M, DEVINE J N. PEEK biomaterials in trauma, orthopedic, and spinal implants [J]. Biomaterials,2007,28(32):4845-4869. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.07.013
    [2] SOBIERAJ M C, KURTZ S M, RIMNAC C M. Notch sensitivity of PEEK in monotonic tension [J]. Biomaterials,2009,30(33):6485-6494. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.08.020
    [3] 周浩浩, 曹慧群, 周莉, 等. 多孔载药n-HA/PEEK/CS复合材料的制备与性能 [J]. 功能高分子学报,2018,31(3):267-272.
    [4] LU T, WEN J, QIAN S, et al. Enhanced osteointegration on tantalum-implanted polyetheretherketone surface with bone-like elastic modulus [J]. Biomaterials,2015,51:173-183. doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.02.018
    [5] MA R, LI Q K, WANG L, et al. Mechanical properties and in vivo study of modified-hydroxyapatite/polyetheretherketone biocomposites [J]. Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications,2017,73:429-439.
    [6] DING Y T, TANG S C, YU B Q, et al. In vitro degradability, bioactivity and primary cell responses to bone cements containing mesoporous magnesium-calcium silicate and calcium sulfate for bone regeneration [J]. Journal of The Royal Society Interface,2015,12(111):20150779. doi: 10.1098/rsif.2015.0779
    [7] ZHU M, ZHANG J, ZHAO S, et al. Three-dimensional printing of cerium-incorporated mesoporous calcium-silicate scaffolds for bone repair [J]. Journal of Materials Science,2016,51(2):836-844. doi: 10.1007/s10853-015-9406-1
    [8] LI C, GAO L, CHEN F, et al. Fabrication of mesoporous calcium silicate/calcium phosphate cement scaffolds with high mechanical strength by freeform fabrication system with micro-droplet jetting [J]. Journal of Materials Science,2015,50(22):7182-7191. doi: 10.1007/s10853-015-9244-1
    [9] CAI L, PAN YK, TANG S C, et al. Macro-mesoporous composites containing PEEK and mesoporous diopside as bone implants: Characterization, in vitro mineralization, cytocompatibility, and vascularization potential and osteogenesis in vivo [J]. Journal of Materials Chemistry B,2017,5(42):8337-8352. doi: 10.1039/C7TB02344H
    [10] CAI L, ZHANG J, QIAN J, et al. The effects of surface bioactivity and sustained-release of genistein from a mesoporous magnesium-calcium-silicate/PK composite stimulating cell responses in vitro, and promoting osteogenesis and enhancing osseointegration in vivo [J]. Biomaterials Science,2018,6(4):842-853. doi: 10.1039/C7BM01017F
    [11] RAIMBAULT O, BENAYOUN S, ANSELME K, et al. The effects of femtosecond laser-textured Ti-6Al-4V on wettability and cell response [J]. Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications,2016,69:311-320.
    [12] CARVALHO A, CANGUEIRO L, OLIVEIRA V, et al. Femtosecond laser microstructured Alumina toughened Zirconia: A new strategy to improve osteogenic differentiation of hMSCs [J]. Applied Surface Science,2018,435:1237-1245. doi: 10.1016/j.apsusc.2017.11.206
    [13] MARTINEZ-CALDERON M, MANSO-SILVAN M, RODRIGUEZ A, et al. Surface micro-and nano-texturing of stainless steel by femtosecond laser for the control of cell migration [J]. Scientific Reports,2016,6:36296. doi: 10.1038/srep36296
    [14] DAVIS K M, MIURA K, SUGIMOTO N, et al. Writing waveguides in glass with a femtosecond laser [J]. Optics Letters,1996,21(21):1729-1731. doi: 10.1364/OL.21.001729
    [15] KONDO Y, QIU J, MITSUYU T, et al. Three-dimensional microdrilling of glass by multiphoton process and chemical etching [J]. Japanese Journal of Applied Physics Part 2: Letters and Express Letters,1999,38(10A):1146-1148.
    [16] MEI S Q, YANG L L, PAN Y K, et al. Influences of tantalum pentoxide and surface coarsening on surface roughness, hydrophilicity, surface energy, protein adsorption and cell responses to PEEK based biocomposite [J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,2019,174:207-215. doi: 10.1016/j.colsurfb.2018.10.081
    [17] KUNZLER T P, DROBEK T, SCHULE R M, et al. Systematic study of osteoblast and fibroblast response to roughness by means of surface-morphology gradients [J]. Biomaterials,2007,28(13):2175-2182. doi: 10.1016/j.biomaterials.2007.01.019
    [18] GUI N, XU W, MYERS D E, et al. The effect of ordered and partially ordered surface topography on bone cell responses: a review [J]. Biomaterials Science,2018,6(2):250-264. doi: 10.1039/C7BM01016H
    [19] DELIGIANNI D D, KATSALA N, LADAS S, et al. Effect of surface roughness of the titanium alloy Ti-6Al-4V on human bone marrow cell response and on protein adsorption [J]. Biomaterials,2001,22(11):1241-1251. doi: 10.1016/S0142-9612(00)00274-X
    [20] 杨健, 贝建中. 组织工程细胞支架及其细胞亲和性改进研究进展 [J]. 功能高分子学报,2000,13(4):455-460. doi: 10.3969/j.issn.1008-9357.2000.04.021
    [21] ZHAO C C, WANG X Y, GAO L, et al. The role of the micro-pattern and nano-topography of hydroxyapatite bioceramics on stimulating osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells [J]. Acta Biomaterialia,2018,73:509-521. doi: 10.1016/j.actbio.2018.04.030
    [22] ZHANG Q, SHEN Y F, JIANG Y Q, et al. Overexpression of miR-182 inhibits ossification of ligamentum flavum cells by targeting NAMPT [J]. Experimental Cell Research,2018,367(2):119-131. doi: 10.1016/j.yexcr.2018.03.008
    [23] STAMP R, FOX P, O'NEILL W, et al. The development of a scanning strategy for the manufacture of porous biomaterials by selective laser melting [J]. Journal of Materials Science: Materials in Medicine,2009,20(9):1839-1848. doi: 10.1007/s10856-009-3763-8
    [24] VOROBYEV A Y, GUO C. Femtosecond laser structuring oftitanium implants [J]. Applied Surface Science,2007,253(17):7272-7280. doi: 10.1016/j.apsusc.2007.03.006
  • [1] 周浩浩曹慧群周莉罗仲宽胡惠媛黄丹榕 . 多孔载药n-HA/PEEK/CS复合材料的制备与性能. 功能高分子学报, doi: 10.14133/j.cnki.1008-9357.20171105002
    [2] 曹俊奎陈艳 . 聚醚醚酮酮的结晶熔融行为. 功能高分子学报,
    [3] 付杜谢续明 . 含氟聚合物共混对聚醚醚酮结晶行为的影响. 功能高分子学报,
    [4] 薄淑琴杨虹 . 一种含酞侧基聚醚醚酮的稀溶液性质的研究(Ⅰ). 功能高分子学报,
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    [6] 蒋钟罗远芳 . 聚芳醚醚酮的热老化寿命研究. 功能高分子学报,
    [7] 卜路嘉袁国雄 . 嵌段共聚物微胶束行为的研究:II.动态激光光散射法研究聚(苯乙烯…. 功能高分子学报,
    [8] 赵晓勇曾一鸣施艳荞陈观文 . 相转化法制备超滤和微滤膜的孔结构控制. 功能高分子学报,
    [9] 陈学思郑国栋 . 带酞基取芳醚酮超滤膜的研究:Ⅰ带酞基聚芳醚酮超滤膜的制备与…. 功能高分子学报,
    [10] 陈学思郑国栋王秋东金敏善陈天禄袁雅佳徐纪平 . 带酞基聚芳醚酮超滤膜的研究──Ⅰ带酞基聚芳醚酮超滤膜的制备与性能. 功能高分子学报,
    [11] 杨雪勤吴健厉从雷包黎凤马忠实宣正伟张骁骅张祥成 . 聚醚酮酮/羟基磷灰石复合植入物的力学性能与生物活性. 功能高分子学报, doi: 10.14133/j.cnki.1008-9357.20190429001
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    [13] 卜路嘉袁国雄李碧琳徐种德 . 嵌段共聚物微胶束行为的研究Ⅱ.动态激光光散射法研究聚(苯乙烯-异戊二烯)二嵌段共聚物在选择性溶剂中微胶束的形成过程. 功能高分子学报,
    [14] 张善举郑玉斌 . 新型热致型液晶苯代聚芳醚酮的单畴液晶行为. 功能高分子学报,
    [15] 柯扬船朱志宁 . 聚芳醚酮膜的溶剂吸附与诱导结晶行为. 功能高分子学报,
    [16] 曹建伟1王志鹏2王红华2周光远2,3李存峰3崔善子1 . 含烯丙基侧基聚芳醚酮的制备及其表征. 功能高分子学报,
    [17] 童身毅张潇 . 含双酚—A和杂环结构的聚芳醚酮的合成与表征. 功能高分子学报,
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    [20] 魏婷周权宋宁倪礼忠 . 氮硼共掺杂有序介孔碳的制备及性能. 功能高分子学报, doi: 10.14133/j.cnki.1008-9357.20180326002
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-06-17
  • 网络出版日期:  2019-11-04

聚醚醚酮/介孔硅酸钙镁复合材料表面周期性微沟槽对细胞行为的影响

    通讯作者: 王雪红, wxhsnow@ecust.edu.cn
    通讯作者: 魏杰, jiewei7860@sina.com
    作者简介: 韩 航(1993-),女,山西文水人,硕士生,主要研究方向为生物医用材料。E-mail:2294268435@qq.com
  • 华东理工大学超细材料制备与应用教育部重点实验室,上海 200237

摘要: 采用飞秒激光在聚醚醚酮/介孔硅酸钙镁复合材料表面构建了不同宽度(20、40 μm和60 μm)的周期性微沟槽,考察了微沟槽宽度对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、增殖与分化的影响。结果表明:飞秒激光在复合材料表面构建不同宽度的周期性微沟槽可以调控细胞的行为。经过飞秒激光精确而超快烧蚀,微沟槽的内表面形成了微纳结构,暴露出大量的介孔硅酸钙镁颗粒,其内表面粗糙度明显提高;随着微沟槽宽度的增加,复合材料表面的蛋白质吸附性能提高,而且明显促进了大鼠骨髓间充质干细胞响应;当微沟槽宽度为60 μm时,复合材料表面显著地促进了细胞黏附、增殖与成骨分化,并且诱导细胞沿着沟槽方向生长。

English Abstract

  • 聚醚醚酮(PEEK)是一种特种高分子材料,由于其具有耐高温、自润滑、耐磨损和抗疲劳等优良的综合性能,已成为当今最热门的高性能工程塑料之一,主要应用于航空航天、汽车工业、食品加工、电子电气和医疗器械等领域[1]。由于无毒、质轻、耐腐蚀,而且具有优良的生物相容性、高力学强度以及弹性模量与骨组织相近等特性,PEEK作为骨修复材料在临床(如颅/颌面、脊柱、关节等修复领域)得到了广泛的应用[2, 3]。但PEEK是生物惰性材料,缺乏生物活性,不能与骨组织形成良好的骨整合,容易导致植入体松动,乃至手术失败[4]。因此,对PEEK进行表面改性,提高其生物活性受到了广泛的关注[5]

    介孔硅酸钙镁(m-MCS)是一种生物活性玻璃,具有纳米孔道,且比表面积大以及孔容高[6]。体内外实验研究表明[7, 8]:m-MCS在生理环境中可释放出一定浓度的硅、钙、镁离子,这些离子能够刺激细胞增殖、分化和相关基因表达,以及促进骨组织再生。尽管m-MCS具有优良的生物相容性和生物活性,但其存在力学强度低、脆性大等缺点。因此,前期研究制备了PEEK/m-MCS复合材料,使之兼具m-MCS优良的生物活性和PEEK优良的力学性能。结果显示:随着m-MCS含量的增加,相比PEEK复合材料的力学强度和生物活性明显提高,能促进成骨细胞黏附、增殖与分化[9, 10]

    飞秒激光(FSL)技术是一种应用前景广阔的纳微制造技术,能在材料表面高效构建可控的纳微结构,已广泛应用于微光学、微电子学、材料学等领域[13]。FSL具有加工操作简单、尺寸精度高、扫描速率快、加工过程中材料表面氧化程度小等优点,能在多种材料(包括金属、陶瓷/玻璃和高分子)表面制备各种纳微图案结构(如凹槽、凸起、凹坑等)[14]。FSL在基材表面制得的纳米/微米尺度、形貌、周期性的纳微结构可能对细胞行为(如黏附、形态、生长及分化等)产生重要影响,利用飞秒激光在材料表面构建纳微图案来调控细胞行为是一个很有前景的研究领域[11, 12, 15]。因此,本研究首次采用飞秒激光技术在PEEK/m-MCS复合材料表面制备不同宽度的微沟槽,研究其对大鼠间充质干细胞(rBMSCs)行为(黏附、增殖和分化等)的影响,有关该方面的研究尚鲜见报道。

    • PEEK:医药级,江门市优巨新材料有限公司;无水乙醇:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;牛血清白蛋白(BSA):纯度为98%,上海慧颖生物科技有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS):纯度为98%,上海抚生生物科技有限公司;μBCA试剂盒:分析纯,Thermo Scientific公司;磷酸盐缓冲液(PBS):优级纯,Thermo Scientific公司;含血清MEM培养基:纯度10%,Sigma-Aldrich公司;电镜专用戊二醛固定液:纯度2.5%,NOVON Scientific公司;CCK-8试剂盒:分析纯,上海翊圣生物科技有限公司;异硫氰酸荧光素标记鬼笔环肽(FITC-phalloidin),4',6'-二脒基-2-苯基(DAPI):纯度>95%,Sigma-Aldrich公司;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒:分析纯, 碧云天生物技术有限公司。

    • 采用傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Electron公司Nicolet 6700型)分析样品的组成,扫描波数范围为4 000~400 cm−1;采用扫描电子显微镜(日本日立公司S-4800型)观察样品表面的微观形貌,测试前对样品进行喷金处理;采用激光共聚焦3D显微镜(日本基恩士公司VK-X110型)观察样品表面的3D形貌,采用物镜(20×)扫描样品表面不同位置,通过计算机辅助图像分析材料的表面粗糙度(Ra);采用酶标仪(中国普朗医疗DNM-9606型)检测样品表面细胞的吸光度;采用激光共聚焦显微镜(日本尼康公司Nikon AIR型)观察样品表面的细胞形态。

    • 根据先前的研究[10]制备m-MCS粉末,将PEEK粉末和m-MCS粉末按质量比为3∶2混合,然后将混合粉末置于不锈钢模具中,采用压片机制备圆盘形样品(Φ12 mm × 2 mm),随后在马弗炉中烧结4 h(烧结温度为350 ℃),将获得的PEEK/m-MCS复合材料(PM)表面进行抛光,超声清洗备用。由于rBMSCs完全铺展后,其尺寸一般在25~40 μm。采用飞秒激光放大器在复合材料表面根据细胞尺寸大小制备微沟槽宽度分别为20 μm(PM20)、40 μm(PM40)和60 μm(PM60)的样品,沟槽深度均为15 μm,飞秒激光加工的参数为:脉冲宽度< 200 fs,中心波长为800 nm,重复频率为1 kHz,扫描速率:600~1 000 μm/s。

    • 将样品置于24孔板中,向每孔中添加1 mL的BSA溶液(质量浓度为10 mg/mL)。在37 ℃下静置4 h后,用PBS轻轻洗涤样品3次,去除松散吸附的蛋白质。然后将样品置于w = 5%的SDS中,在37 ℃下晃动以释放紧紧吸附的蛋白质。收集含有蛋白质的溶液,用μBCA试剂盒定量测定蛋白质含量。蛋白质吸附结果以每单位质量样品吸附BSA的质量(mg蛋白质/g样品)表示。

    • 采用CCK-8试剂盒,考察rBMSCs在样品表面的黏附情况。从鼠龄3~4 w,体重70~120 g的SD大鼠(雌雄不限)四肢中提取rBMSCs,采用第3~5代细胞进行体外细胞实验。将样品用去离子水清洗,再用高压灭菌锅灭菌后置入24孔培养板中,将rBMSCs(1 mL溶液中约含2 × 104个)接种到样品表面。将培养板置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中,于6、12 h和24 h,分别将样品取出放入新的培养板中,每孔中加入新鲜培养基(400 μL)和CCK-8溶液(40 μL),空白对照组做相同的处理。在培养箱内孵育4 h,然后从每孔内吸取100 μL液体转入96孔板中,做好标记,最后采用酶标仪在450 nm和650 nm(参比波长)处测定吸光度值(OD)。

      采用CCK-8试剂盒,考察rBMSCs在样品表面的增殖情况。将细胞在样品上培养1、3 d和7 d,去除MEM培养基,用PBS轻洗3遍样品表面以除去残余液体,然后用戊二醛固定细胞;在避光条件下,加入FITC-phalloidin(每孔200 μL),染色(细胞骨架)20 min后用PBS洗5遍;接着加入DAPI (每孔200 μL),染色(细胞核)10 min,PBS洗5遍;采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态及细胞的铺展情况。将细胞在样品上培养1、3 d和7 d,取出样品置入新的培养板中,在CCK-8溶液中孵育4 h,最后采用酶标仪在450 nm和650 nm处测定吸光度值(OD)。

      通过检测在样品表面培养细胞的ALP活性来评价其成骨分化情况。将细胞接种在样品上,待细胞全部黏附在样品表面后,更换成成骨诱导培养液继续培养,每3 d更换一次培养液,培养7、10 d和14 d,进行ALP活性测定。在特定时间点,吸去旧培养基,加入细胞裂解液浸没样品,放入37 ℃恒温震荡箱中孵育90 min。加入μBCA试剂,以牛血清白蛋白作为标准蛋白质,在562 nm的波长下测定裂解物中的总蛋白质含量。在裂解物中加入100 μLALP工作溶液20 min,最后加入NaOH溶液(100 μL,0.1 mol/L)终止反应。使用酶标仪在405 nm波长下测定吸光度,ALP活性表示为405 nm处的吸光度值与总蛋白质含量之比。

    • 所有实验至少进行3次,获得的数据均通过OriginPro 8.0(美国,OriginLab Corporation)软件进行处理。数据表示为平均值±标准差(M ± SD),n = 3。 通过单因素方差(ANOVA)分析和Tukey检验进行统计学分析。当p < 0.05时,结果具有统计学意义。

    • 图1为m-MCS、PEEK、PM和PM60的FT-IR谱图。对于m-MCS,在1 095 cm−1和799 cm−1处出现了Si―O―Si反对称伸缩振动峰。对于PEEK,1 652 cm−1处为C=O羰基伸缩振动带,15 971 cm1−1和15 011 cm1−1处为R―O―R苯环平面内振动峰,1 308 cm−1处为R―CO―R苯面内振动带,1 226 cm−1处为R―O―R不对称伸缩振动带,929 cm−1处为R―CO―R对称伸缩振动峰,1 163 cm−1为C―H在芳环中的面内弯曲振动带,840 cm−1和764 cm−1处为 C–H苯环外弯曲振动带[16]。对于PM和PM60,可以观察到m-MCS和PEEK的特征峰。这些结果表明:经过飞秒激光改性后,PM60表面没有出现新的特征峰,表明复合材料改性后,其组成结构未发生变化。

      图  1  m-MCS、PEEK、PM和PM60的FT-IR谱图

      Figure 1.  FT-IR spectra of m-MCS、PEEK、PM and PM60

    • 图2(a~c)为 PM20、PM40和PM60的激光共聚焦3D显微镜照片。飞秒激光在复合材料表面形成了周期性的微沟槽,沟槽宽度分别为20、40 μm和60 μm(沟深均为15 μm)。图2(d)图2c中白色箭头所指区域的粗糙度表征。结果显示:沟槽脊(Area1)的粗糙度为(1.53 ± 0.21) μm,沟槽内表面(Area2)的粗糙度为(5.15 ± 0.35) μm。表明复合材料经飞秒激光精确而超快烧蚀后,其表面的PEEK被气化,形成微沟槽,内表面暴露大量的m-MCS,粗糙度明显增加。以上研究表明:生物材料表面粗糙度在1.12~5.70 μm时,有利于成骨细胞附着,而且细胞在材料表面的黏附随其粗糙度增加而提高[17]

      图  2  PM20(a)、PM40(b)和PM60(c)的激光共聚焦3D显微镜照片,(d)为(c)中白色箭头所指区域的粗糙度(*代表p < 0.05)

      Figure 2.  Laser confocal 3D micrographs of PM20 (a), PM40 (b) and PM60 (c), and surface roughness (d) of the area indicated by the white arrow in (c) (* represents p < 0.05)

    • 图3(a~d)为 PM20、PM40和PM60的SEM照片。飞秒激光在复合材料表面构建了宽度为20、40 μm和60 μm的微沟槽,且不同宽度微沟槽的内表面均为微纳结构,没有明显的区别。从图3(d)中可以看出,微沟槽内表面为微米丝状结构,这是由于表面PEEK被激光烧蚀,暴露出大量的m-MCS颗粒(含有纳米孔)。

      图  3  PM20(a)、PM40(b)和PM60(c, d)表面微观形貌的SEM照片

      Figure 3.  SEM photographs of PM20 (a), PM40 (b) and PM60 (c, d)

    • 图4(a)为样品对牛血清白蛋白的吸附性。PM、PM20、PM40和PM60对蛋白质的吸附量分别为(0.29 ± 0.10)mg/g,(0.83 ± 0.08)mg/g,(1.42 ± 0.09)mg/g和(1.73 ± 0.08)mg/g。随着微沟槽宽度的增加,蛋白质的吸附量而增加。图4(b)为rBMSCs在样品表面培养不同时间后的黏附情况。培养6 h,细胞在PM20和PM40表面的黏附量没有显著性差异;培养12、24 h,细胞在PM40表面的黏附量显著高于PM20和PM;在所有的时间点,PM60表面细胞的黏附量最高。

      图  4  (a)样品在BSA溶液中浸泡24 h后的蛋白吸附量;(b)rBMSCs在样品表面培养不同时间的细胞黏附情况

      Figure 4.  (a) BSA protein adsorption on samples after soaking in bovine serum albumin solution for 24 h; (b) rBMSCs adhesion on the samples after cultivated for different time

      这是由于随着沟槽宽度增加,暴露的m-MCS颗粒越多;沟槽越宽,具有微纳结构和高粗糙度的内表面积就越大,复合材料表面的亲水性(m-MCS具有高亲水性)就越高[9],这些表面特征有利于蛋白质吸附,而蛋白质吸附有利于细胞的早期黏附[17-20]。另外,微纳结构能够为细胞提供更多的结合位点,在纳米尺度上与细胞伪足相互作用,从而提高细胞的黏附性[21]

    • 图5为rBMSCs在样品表面培养1 d(图5(a))、3 d(图5(b))和7 d(图5(c))的激光共聚焦照片。从图5(a)可以看出:细胞在PM表面比较散乱;在PM20表面也没有特定的生长取向;当少量细胞在PM40表面沿着沟槽生长,部分细胞黏附在沟槽脊上;大部分细胞在PM60表面沿着沟槽定向生长,部分细胞有丝状伪足伸出。由于微沟槽的内表面具有微纳结构,并暴露大量的m-MCS颗粒,其粗糙度和亲水性明显高于沟槽脊[9],因此,细胞倾向沿着沟槽内表面黏附和生长。当沟槽尺寸小于细胞尺寸时,不利于细胞沿着沟槽黏附和长入;当沟槽宽度为40 μm时,沟槽的尺寸与细胞的尺寸相近,细胞倾向沿着沟槽生长;当沟槽宽度为60 μm时,沟槽的尺寸略微大于细胞的尺寸,更加有利于细胞沿着沟槽定向生长。

      图  5  rBMSCs在PM(a)、PM20(b)、PM40(c)和PM60(d)表面培养后的细胞形态的激光共聚焦照片

      Figure 5.  Laser confocal photographs of cell morphology of rBMSCs cultivated on the surface of PM(a), PM20 (b), PM40 (c) and PM60 (d)

      图5(b)可以看出:细胞在PM表面随机生长;在PM20表面,细胞没有明显的生长取向,也没有明显铺展;在PM40表面细胞沿着沟槽生长,并明显铺展,显示细长条状形貌;在PM60表面细胞沿着沟槽生长,铺展更好,多个细胞叠在一起定向生长。从图5(c)可知:细胞培养7 d后,大量细胞在PM40和PM60表面沿着沟槽定向生长。

    • 图6(a)为rBMSCs 在样品表面培养不同时间的细胞增殖情况。结果显示:在1 d、3 d和7 d,细胞在PM表面的吸光度都最低,表明细胞增殖最差;而细胞在PM60表面的吸光度都高,表明细胞增殖最好。图6(b)为rBMSCs 在样品表面培养不同时间的ALP活性表达的情况。ALP通常被认为是细胞成骨分化的标志物[22]。结果显示:在7 d、10 d和14 d,细胞在PM表面的ALP活性都最低,表明细胞成骨分化最低;而细胞在PM60表面的ALP活性都高,表明细胞成骨分化最好。上述结果表明:随着微沟槽宽度的增加,越有利于细胞沿着沟槽增殖和成骨分化。

      图  6  rBMSCs在样品表面培养不同时间后的细胞增殖情况(a)和ALP活性(b)

      Figure 6.  Cell proliferation (a) and ALP activity (b) after rBMSCs cultivated on the surface of samples for different time

      生物材料表面的粗糙度和微纳结构不仅有利于细胞的黏附和铺展,而且能诱导细胞增殖和成骨分化[23, 24]。本文的结果表明:经飞秒激光精确而超快烧蚀,在复合材料表面形成不同宽度的周期性微沟槽;沟槽内表面形成了微纳结构,暴露出大量的m-MCS颗粒,其表面粗糙度增加;沟槽宽度越宽,沟槽的内表面积就越大;因此,随着沟槽宽度增加,蛋白质吸附提高,越有利于细胞黏附和生长。而且,微沟槽宽度明显影响细胞行为(黏附、增殖及分化等),当微沟槽宽度小于细胞体积,细胞不能长入其内部;当微沟槽宽度大于细胞体积,有利于细胞长入其内部,沿沟槽生长。简而言之,相比于PM20,更宽的微沟槽(PM60)不仅内表面形成了更多的微纳结构,暴露出更多的m-MCS颗粒,而且可以容纳细胞长入,因而促进了细胞响应。

    • (1)采用飞秒激光在PEEK/m-MCS复合材料表面构建了不同宽度(20 μm、40 μm和60 μm)的周期性微沟槽。

      (2)微沟槽内表面形成了微纳结构,暴露出大量的m-MCS颗粒,因而粗糙度提高;随着微沟槽宽度的增加,蛋白质吸附性提高。

      (3)微沟槽宽度明显影响rBMSCs的响应,当微沟槽宽度为60 μm时,复合材料表面显著地促进了细胞黏附、增殖与分化,并且诱导细胞沿着沟槽方向生长。

参考文献 (24)

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