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近年来，应用高效液相色谱手性固定相法对手性化合物进行直接分离的技术发展迅速，目前已成为对映体分离、光学纯度分析、不对称合成反应检测和光学纯对映体制备等现代诸多交叉领域最重要的技术之一[1-6]。其中，由多聚糖类衍生物（尤其是纤维素和直链淀粉苯基氨基甲酸酯）制备而成的手性分离材料能够对90%以上的手性化合物表现出识别能力，其高效的手性识别性能使其成为该领域的研究热点，也是目前最受欢迎的手性分离材料[7-11]。有趣的是，对于二级结构不同的多聚糖，如纤维素与直链淀粉，它们在衍生化后不仅呈现出截然不同的手性分离性能，而且对于很多手性化合物还表现出互补的拆分性能[12-16]。基于该性能特征，若能够将不同类型的多聚糖衍生物进行混合而制备混杂型手性固定相，可能会进一步提高多聚糖类手性固定相的分离效能并拓宽所能拆分手性化合物的类型，有关这方面的报道相对较少[17]。
基于以上思路，本文合成了3种具有不同侧链结构的纤维素和直链淀粉苯基氨基甲酸酯类衍生物，并基于所合成衍生物，运用两种不同方法将直链淀粉类和纤维素类衍生物两两混合制备混杂型多聚糖类手性固定相，并通过高效液相色谱法（HPLC）对所制备混杂型手性固定相的手性分离性能进行评价与分析。
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微晶纤维素（聚合度为200）、直链淀粉（聚合度为300）：Merck公司；手性化合物（Rac-1～Rac-10）：分析纯，Sigma-Aldrich上海分公司；正己烷、异丙醇：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司。所有反应试剂使用前均经过减压蒸馏处理。
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1H-NMR核磁共振波谱仪（德国Bruker公司500 MHz）：80 ℃，以氘代吡啶（Pyridine-d5）为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标；热重分析仪（美国TA公司Q50）：N2气氛，温度范围为室温～800 ℃；高效液相色谱（HPLC）工作站（日本JASCO公司UV-2070 Plus，CD-2095）：色谱柱规格为25 cm×0.20 cm，流速为0.1 mL/min，检测波长为254 nm，流动相为色谱纯正己烷-异丙醇（体积比为90/10）。
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运用“一锅法”合成3种多糖类衍生物，分别为直链淀粉-三（苯基氨基甲酸酯）（A1）、纤维素-三（苯基氨基甲酸酯）（C1）和纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（C2）。具体合成方法参照文献[18]，合成路线如图1所示。
图 1 多聚糖类衍生物（A1，C1，C2）的合成路线
Figure 1. Synthesis route of polysaccharide derivatives（A1, C1, C2）
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基于所合成的多聚糖衍生物（A1，C1，C2）与硅胶结合，制备了3种涂覆型手性固定相材料（CSP-A1，CSP-C1，CSP-C2），其结构示意图如图2所示，制备方法参照文献[18]。
图 2 4种混杂型多聚糖类手性固定相的结构示意图
Figure 2. Structures of four mixed-type polysaccharide-based chiral stationary phases
基于以上所制备的3种涂覆型多聚糖类手性固定相，将直链淀粉类与纤维素类衍生物按照等物质的量以两种不同方式进行混合制备混杂型固定相。第一种方式是先混合再涂覆获得混杂型手性固定相CSP-1和CSP-2；第二种方式是先涂覆再混合得到混杂型手性固定相CSP-1′和CSP-2′。本文共制备4种混杂型多聚糖类手性固定相CSP-1、CSP-2、CSP-1′、CSP-2′，具体结构如图2所示。经TG分析确定所制备固定相的涂覆率分别为19.5%（CSP-1），18.1%（CSP-2），18.9%（CSP-1′），18.4%（CSP-2′）。
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应用HPLC评价所制备4种混杂型手性固定相对10种手性化合物（Rac-1～Rac-10，图3）的手性分离性能。具体条件参照文献[18]。
图 3 手性化合物Rac-1～Rac-10的分子结构
Figure 3. Chemical structures of racemates Rac-1–Rac-10
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用1H-NMR对所合成多聚糖衍生物（A1，C1，C2）的结构和取代度进行详细表征。其中，C1的1H-NMR谱图示于图4中。从图中可见，C1各个基团质子的特征峰均可明确归属，从低场到高场各谱峰的归属具体如下：化学位移10.22～9.21处为糖单元上引入苯基氨基甲酸酯侧基的氨基峰，8.20～6.69处为苯环的质子峰，5.65～3.31处是糖单元的质子峰。各质子峰的面积比与理论值（3∶15∶7）非常接近，表明衍生物C1的结构规整。衍生物A1和C2的结构分析同C1，在此不再赘述。
图 4 C1的1H-NMR谱图
Figure 4. 1H-NMR spectrum of C1
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图5为手性化合物黄烷酮（Rac-7）在手性固定相CSP-1上的HPLC拆分谱图，由先后洗脱的一对对映体的保留时间（t1，t2）及死时间（t0）可计算得到分离因子（α）为1.74。该结果表明Rac-7在本文所制备混杂型手性固定相CSP-1上实现了高效的基线分离。
图 5 Rac-7在CSP-1上的色谱拆分图
Figure 5. Chromatogram for the resolution of Rac-7 on CSP-1
表1中列出4种混杂型手性固定相的手性分离性能。将相应的单一型多聚糖类手性固定相（A1、C1、C2）的手性分离性能也同时列于表1中，便于对比分析。
Racemates CSP-11) CSP-21) CSP-1′1) CSP-2′1) A12) C12) C23) k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α Rac-1 0.33(+) 1.28 0.74(+) 1.46 0.75(+) 1.32 0.67(+) 1.44 0.77(+) 1.28 1.12(+) 1.37 0.97(−) 1.32 Rac-2 0.20(+) 1.20 0.58(−) 1.18 0.39(+) 1.44 0.54(−) 1.20 0.39(+) 1.46 0.67(+) 1.46 0.51(+) 1.55 Rac-3 1.46(+) 1.26 2.84(+) 1.12 2.30(+) 1.09 2.40(+) 1.12 3.72(+) ～1 5.28(+) ～1 2.43(−) 1.58 Rac-4 0.47(−) ～1 0.30 1.00 0.20 1.00 0.30 1.00 1.19(−) ～1 1.88(−) 1.17 1.17(−) 1.15 Rac-5 0.44 1.00 1.57(−) 1.92 0.97(−) 1.29 1.25(−) 1.93 0.61 1.00 1.56(−) 1.45 2.13(+) 2.59 Rac-6 0.90(+) ～1 1.01(+) 1.24 2.27(+) ～1 0.86(+) 1.22 1.80(−) 1.28 2.57(+) 1.24 0.42(+) ～1 Rac-7 0.76(+) 1.74 1.63(+) 1.29 1.57(+) 1.39 1.45(+) 1.28 2.21(+) 1.51 2.22(+) 1.10 1.47(−) 1.41 Rac-8 0.15 1.00 0.40(+) 1.19 0.26 1.00 0.35(+) 1.12 Rac-9 2.66 1.00 1.83 1.00 1.19 1.00 1.68 1.00 Rac-10 0.56(+) 1.65 0.72 1.00 0.59 1.00 0.62 1.00 1),2) Column: 25 cm × 0.20 cm ID; Flow rate: 0.1 mL/min; Eluent: hexane/2-propanol (VHexane/V2-Propanol=90/100); The signs in parentheses represent the circular dichroism detection at 254 nm of the first-eluted enantiomer; 2),3) Data taken from Ref. [19]; 3) Column: 25 cm×0.46 cm ID; Flow rate: 0.5 mL/min; Eluent: hexane/2-propanol (VHexane/V2-Propanol=90/100); The signs in parentheses represent the optical rotation detection at 254 nm of the first-eluted enantiomer 表 1 混杂型手性固定相1)和单一型手性固定相2),3)的 HPLC 手性分离性能
Table 1. HPLC enantioseparation abilities of mixed-type chiral stationary phase1) and mono-type chiral stationary phase2),3)
由表1可见，总体上，4种混杂型手性固定相具有较好的手性分离性能，均能有效拆分4种及以上的手性化合物，其中CSP-2和CSP-2′的手性分离性能远高于CSP-1和CSP-1′，可对7种手性化合物实现有效拆分。尽管这两对固定相均由A1和另一种纤维素衍生物混合制备而成，但两对固定相的分离性能具有较大的差别。例如，手性化合物Rac-1、Rac-5、Rac-6、Rac-8在CSP-2/CSP-2′两对混杂型固定相上的分离效果大大优于在CSP-1/CSP-1′固定相上的分离效果。这一现象表明，该类混杂型固定相中所混合衍生物种类及其所带侧基的结构差异对其分离性能具有较大影响。其中，C2优异的手性识别性能对CSP-2/CSP-2′固定相的高效分离性能具有较大的贡献。
此外，与单一型手性固定相相比，混杂型固定相对于一些对映体显示出明显的手性分离优势。如Rac-3和Rac-7在混杂型固定相CSP-1上的分离因子大大高于其在相应单一型手性固定相ATPC或CTPC上的分离因子，尤其对于无法在后者被分离的Rac-3，却能在前者获得高效的基线分离。混杂型固定相CSP-2和CSP-2′也可对手性化合物Rac-1、Rac-5和Rac-6显示出高于单一型固定相的分离效能。这可能是由于直链淀粉和纤维素类衍生物本身二级结构存在差异，具有互补的手性识别性能，当将这两者合二为一制备成混杂型固定相后，可对他们各自具有拆分优势的手性化合物实现有效识别与分离，也即拓宽了固定相的可拆分范围，从而可有效增强该混杂型手性固定相的分离效能。该制备方法可为进一步探索开发新型具有高效手性分离性能的固定相材料提供新思路。与此同时，对于在单一型固定相上具有相反洗脱顺序的一些手性化合物，在混杂型固定相上表现出下降的分离效能甚至无法被识别。如Rac-6，尽管该对映体在单一型固定相ATPC和CTPC上均可获得基线分离，但由于在ATPC和CTPC上的洗脱顺序正好相反，导致其在混杂型固定相CSP-1上无法获得拆分。产生这一结果的原因，可能是因为Rac-6在单一型固定相ATPC和CTPC上的识别机理不同，当两个不同结构的衍生物混合为一体后，Rac-6与两种衍生物所产生的手性识别作用相互削弱，从而减弱甚至抵消了其对映体选择性，导致其无法分离。
而基于不同混合方式所得到的CSP-1/CSP-1′以及CSP-2/CSP-2′两对混杂型固定相，彼此表现出较为相近的分离性能，表明不同的混合方式对于该类混杂型固定相的手性分离性能没有显著影响。
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应用“一锅法”合成了一种直链淀粉衍生物（A1）和两种纤维素衍生物（C1、C2），以先混合后涂覆和先涂覆后混合两种方式制备了4种混杂型手性固定相。由不同类型衍生物（A1与C2）组成的混杂型手性固定相CSP-2/CSP-2'表现出更高的拆分性能。与单一型固定相相比，一些手性化合物如Rac-1、Rac-3、Rac-5、Rac-6和Rac-7可在混杂型固定相上获得更高效的分离。
混杂型多聚糖类手性固定相的制备及手性分离性能
Preparation and Enantioseparation Performance of Mixed-Type Polysaccharide-Based Chiral Stationary Phases
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摘要: 运用“一锅法”合成直链淀粉-三（苯基氨基甲酸酯）（A1）、纤维素-三（苯基氨基甲酸酯）（C1）和纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（C2）衍生物。用1H-NMR对衍生物的分子结构进行定量表征，确定其结构规整，取代完全。分别将所合成直链淀粉衍生物与纤维素衍生物以两种不同混合方式涂覆到大孔硅胶上制备混杂型手性固定相，并应用高效液相色谱法（HPLC）评价其对10种手性化合物的手性分离性能。与传统单一型手性固定相相比，所制备的混杂型手性固定相对于一些对映体表现出更优异的分离效能。Abstract: Amylose tris(phenylcarbamate) (A1), cellulose tris(phenylcarbamate) (C1) and cellulose tris(3,5-dimethyl phenylcarbamate) (C2) were synthesized by " one-pot” method. The structures of the derivatives were quantitatively characterized by 1H-NMR. The regular structure and complete substitution of the derivatives were confirmed. The obtained amylose and cellulose derivatives were then coated on the macroporous silica gel, giving rise to mixed-type chiral stationary phases (CSPs) by two mixing ways. Their enantioseparation abilities for ten chiral compounds were evaluated by HPLC. The chiral recognition abilities of the obtained mixed-type CSPs were compared with those of several single polysaccharide-based CSPs (commercialized coated-type CSP derived from C2), including A1, C1 and Chiralcel OD. The results showed that the mixed-type CSPs, especially those mixing with A1 and C2, exhibited higher enantioseparation performance for some chiral compounds, which could be ascribed to the combined enantioseparation abilities derived from the cellulose and amylose derivatives with different higher order structures in the mixed-type CSPs. The mixing methods, either before or after coating process, had no remarkable influences on the chiral recognition ability of the obtained CSPs. However, some mixed-type CSPs showed decreased enantioseparation abilities for a few chiral compounds, which have opposite elution orders on the two single CSPs. This work suggests that the mixed CSPs is probably more efficient for the improvement on the chiral recognition abilities in case both single CSPs follow the similar recognition mechanism.
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Key words:
- enantioseparation /
- chiral recognition /
- chiral stationary phases (CSPs) /
- cellulose /
- amylose
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图 1 多聚糖类衍生物（A1，C1，C2）的合成路线
Figure 1. Synthesis route of polysaccharide derivatives（A1, C1, C2）
图 2 4种混杂型多聚糖类手性固定相的结构示意图
Figure 2. Structures of four mixed-type polysaccharide-based chiral stationary phases
表 1 混杂型手性固定相1)和单一型手性固定相2),3)的 HPLC 手性分离性能
Table 1. HPLC enantioseparation abilities of mixed-type chiral stationary phase1) and mono-type chiral stationary phase2),3)
Racemates CSP-11) CSP-21) CSP-1′1) CSP-2′1) A12) C12) C23) k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α k1 α Rac-1 0.33(+) 1.28 0.74(+) 1.46 0.75(+) 1.32 0.67(+) 1.44 0.77(+) 1.28 1.12(+) 1.37 0.97(−) 1.32 Rac-2 0.20(+) 1.20 0.58(−) 1.18 0.39(+) 1.44 0.54(−) 1.20 0.39(+) 1.46 0.67(+) 1.46 0.51(+) 1.55 Rac-3 1.46(+) 1.26 2.84(+) 1.12 2.30(+) 1.09 2.40(+) 1.12 3.72(+) ～1 5.28(+) ～1 2.43(−) 1.58 Rac-4 0.47(−) ～1 0.30 1.00 0.20 1.00 0.30 1.00 1.19(−) ～1 1.88(−) 1.17 1.17(−) 1.15 Rac-5 0.44 1.00 1.57(−) 1.92 0.97(−) 1.29 1.25(−) 1.93 0.61 1.00 1.56(−) 1.45 2.13(+) 2.59 Rac-6 0.90(+) ～1 1.01(+) 1.24 2.27(+) ～1 0.86(+) 1.22 1.80(−) 1.28 2.57(+) 1.24 0.42(+) ～1 Rac-7 0.76(+) 1.74 1.63(+) 1.29 1.57(+) 1.39 1.45(+) 1.28 2.21(+) 1.51 2.22(+) 1.10 1.47(−) 1.41 Rac-8 0.15 1.00 0.40(+) 1.19 0.26 1.00 0.35(+) 1.12 Rac-9 2.66 1.00 1.83 1.00 1.19 1.00 1.68 1.00 Rac-10 0.56(+) 1.65 0.72 1.00 0.59 1.00 0.62 1.00 1),2) Column: 25 cm × 0.20 cm ID; Flow rate: 0.1 mL/min; Eluent: hexane/2-propanol (VHexane/V2-Propanol=90/100); The signs in parentheses represent the circular dichroism detection at 254 nm of the first-eluted enantiomer; 2),3) Data taken from Ref. [19]; 3) Column: 25 cm×0.46 cm ID; Flow rate: 0.5 mL/min; Eluent: hexane/2-propanol (VHexane/V2-Propanol=90/100); The signs in parentheses represent the optical rotation detection at 254 nm of the first-eluted enantiomer 
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图(6)表(1)
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