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PEG化羟甲基小白菊内酯抗肿瘤前药纳米颗粒的制备及性能

屈文豪 杨全军 黄平 黄卫 颜德岳

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PEG化羟甲基小白菊内酯抗肿瘤前药纳米颗粒的制备及性能

    作者简介: 屈文豪(1994-12),男,湖北襄阳人,硕士生,研究方向:小分子化疗药物的纳米化。E-mail:sjtuqu1207@sjtu.edu.cn.
    通讯作者: 黄平, hp158@sjtu.edu.cn ; 黄卫, hw66@sjtu.edu.cn
  • 中图分类号: O63

Preparation and property of PEGylated melampomagnolide B prodrug nanoparticles for cancer therapy

    Corresponding author: HUANG Ping, hp158@sjtu.edu.cn ;HUANG Wei, hw66@sjtu.edu.cn ;
  • CLC number: O63

  • 摘要: 通过酯化反应将羧基聚乙二醇单甲醚(mPEG10-COOH)与MMB进行偶联得到两亲性前药mPEG10-MMB,其化学结构通过核磁共振(NMR)和液相色谱-质谱(LC-MS)联用表征得到确认。基于mPEG10-MMB的两亲性分子结构,在水中可自组装形成纳米颗粒,其临界胶束浓度为7.7 μg/mL。动态光散射(DLS)测试结果表明:mPEG10-MMB前药纳米颗粒的粒径约为120.3 nm,且粒径分布较窄。透射电子显微镜(TEM)测试结果表明:mPEG10-MMB前药纳米颗粒呈球形,粒径约为108.5 nm。以尼罗红为荧光探针负载到mPEG10-MMB前药纳米颗粒中,采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜(CLSM)检测了mPEG10-MMB前药纳米颗粒进入肿瘤细胞的情况,结果表明,mPEG10-MMB前药纳米颗粒主要通过内吞方式进入HeLa肿瘤细胞。MTT结果表明,mPEG10-MMB前药纳米颗粒比游离MMB具有更好的抗肿瘤活性,但对正常细胞的毒性相对较低。
  • 图 1  两亲性前药mPEG10-MMB的合成、自组装及药物输送

    Figure 1.  Synthesis, self-assembly and drug delivery of amphiphilic mPEG10-MMB prodrug

    图 2  样品的1H-NMR谱

    Figure 2.  1H-NMR spectra of samples

    图 3  mPEG10-COOH和mPEG10-MMB前药的LC-MS谱图

    Figure 3.  LC-MS spectra of mPEG10-COOH and mPEG10-MMB prodrug

    图 4  mPEG10-COOH、MMB和mPEG10-MMB前药的UV-Vis谱图

    Figure 4.  UV-Vis spectra of mPEG10-COOH, MMB and mPEG10-MMB prodrug (ρ (sample) = 20 μg/mL)

    图 5  mPEG10-MMB前药纳米颗粒的DLS曲线(a)和TEM照片(b)

    Figure 5.  DLS curve (a) and TEM image (b) of mPEG10-MMB prodrug nanoparticles

    图 6  水溶液中NR的最大荧光发射强度与mPEG10-MMB前药浓度的关系

    Figure 6.  Maximum emission intensity of NR versus the concentration of mPEG10-MMB

    图 7  流式细胞仪测得的与封装NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒孵育不同时间后HeLa细胞内的几何平均荧光强度(插图为未处理的HeLa细胞(a)和与封装NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒培养4 h后的Hela细胞(b)分别测得的流式细胞曲线)

    Figure 7.  Time-dependent profiles of NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles fluorescence intensity in HeLa cells by flow cytometry analysis (Insert: representative flow cytometry histogram profiles of HeLa cells cultured with NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles for 4 h, the untreated cells are used as a control)

    图 8  负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒与HeLa细胞培养4 h的激光共聚焦显微镜照片(细胞核用DAPI染色)

    Figure 8.  CLSM images of HeLa cells incubated with NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles for 4 h (Cell nuclei are stained with DAPI)

    图 9  MTT法测得的MMB和mPEG10-MMB前药纳米颗粒对HeLa细胞的细胞毒性

    Figure 9.  In vitro cytotoxicity of MMB and mPEG10-MMB prodrug nanoparticles to HeLa cells determined by MTT assay

    图 10  MTT法测得mPEG10-MMB前药纳米颗粒对BRL-3A细胞的毒性

    Figure 10.  In vitro cytotoxicity of mPEG10-MMB prodrug nanoparticles to BRL-3A cells determined by MTT assay

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-24
  • 网络出版日期:  2019-05-23

PEG化羟甲基小白菊内酯抗肿瘤前药纳米颗粒的制备及性能

    通讯作者: 黄平, hp158@sjtu.edu.cn
    通讯作者: 黄卫, hw66@sjtu.edu.cn
    作者简介: 屈文豪(1994-12),男,湖北襄阳人,硕士生,研究方向:小分子化疗药物的纳米化。E-mail:sjtuqu1207@sjtu.edu.cn
  • 1. 上海交通大学化学化工学院,金属基复合材料国家重点实验室,上海 200240
  • 2. 上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海 200233

摘要: 通过酯化反应将羧基聚乙二醇单甲醚(mPEG10-COOH)与MMB进行偶联得到两亲性前药mPEG10-MMB,其化学结构通过核磁共振(NMR)和液相色谱-质谱(LC-MS)联用表征得到确认。基于mPEG10-MMB的两亲性分子结构,在水中可自组装形成纳米颗粒,其临界胶束浓度为7.7 μg/mL。动态光散射(DLS)测试结果表明:mPEG10-MMB前药纳米颗粒的粒径约为120.3 nm,且粒径分布较窄。透射电子显微镜(TEM)测试结果表明:mPEG10-MMB前药纳米颗粒呈球形,粒径约为108.5 nm。以尼罗红为荧光探针负载到mPEG10-MMB前药纳米颗粒中,采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜(CLSM)检测了mPEG10-MMB前药纳米颗粒进入肿瘤细胞的情况,结果表明,mPEG10-MMB前药纳米颗粒主要通过内吞方式进入HeLa肿瘤细胞。MTT结果表明,mPEG10-MMB前药纳米颗粒比游离MMB具有更好的抗肿瘤活性,但对正常细胞的毒性相对较低。

English Abstract

  • 小白菊内酯(PTL)是从菊科植物中提取出来的一类倍半萜内酯天然产物,对乳腺癌、结肠癌和白血病等众多癌症具有良好的生物活性[1, 2]。其主要通过与核因子(NF-κB)、信号传导与转录激活子(STATs)、应激活化蛋白(JNK)等多种信号通路中的蛋白相互作用以及诱导细胞内活性氧簇(ROS)来调控细胞中的各类免疫应答反应[3-6]。小白菊内酯衍生物羟甲基小白菊内酯(MMB)的生物活性与小白菊内酯类似,可从洋玉兰的根皮中提取得到[7],也可在二氧化硒/过氧化叔丁醇(SeO2/tBuOOH)催化下由小白菊内酯经氧化反应得到[8, 9]。与PTL相比,由于MMB的C-14位上引入一个伯羟基,故可对其进行进一步化学修饰,以提高其水溶性、生物利用度及靶向能力。例如,Chen等[10]通过化学修饰,在羟甲基小白菊内酯C-14位点引入不同基团构建了一系列衍生物,其中部分衍生物显示出较高的抗癌活性。Peter等[11]合成了一系列羟甲基小白菊内酯的氨基甲酸酯和碳酸酯二聚体衍生物,可有效改善其水溶性,并评估了所得衍生物对血液肿瘤和实体肿瘤细胞(如结肠癌、乳腺癌、胶质细胞瘤等)的抗癌活性。上述化学修饰在一定程度上改善了羟甲基小白菊内酯的水溶性,部分衍生物的抗癌活性还有所提高,但仍属于小分子化合物,存在在人体内血液停留时间短、生物利用度低且选择性差等问题。

    近年来,纳米药物载体的输送体系发展日新月异[12, 13]。纳米药物载体在药物输送上具有独特的优势,通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR),它们可被动靶向到肿瘤部位并富集[14, 15],并通过胞吞的方式大量进入肿瘤细胞,释放出药物,发挥良好的治疗作用[16, 17]。目前,已报道了大量基于纳米药物载体的药物输送体系[18-20],如Chang等[21]采用嵌段共聚物聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯-co-γ-羟基-ε-己内酯)自组装负载化疗药物阿霉素,得到粒径为100~140 nm的载药胶束,具有较高的载药量、良好的缓释作用和抗肿瘤活性。Xiong等[18]设计了一类水溶性多糖并将其作为化疗药物多柔比星的载体,制得了聚电解质复合药物纳米颗粒,载药纳米颗粒的稳定性较高,细胞摄取显著增强。但大多数纳米药物载体不易通过美国食品药物管理局(FDA)的认证,临床应用困难。聚乙二醇(PEG)是目前FDA批准的少数可用于人体的医用聚合物敷料,并已广泛应用于药物输送领域[22]。经PEG修饰的小分子药物可自组装形成纳米颗粒,具有较长的体内循环时间、较小的生物毒性、较高的生物利用度和较好的治疗效果[23],如PEG修饰的喜树碱、紫杉醇等纳米药物目前已进入临床实验阶段[24]

    本文拟采用PEG对羟甲基小白菊内酯进行修饰,构建一类基于羟甲基小白菊内酯的前药纳米颗粒,详细研究思路如图1所示。首先,在二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)催化下。由MMB与mPEG10-COOH经一步酯化反应缩合得到两亲性前药mPEG10-MMB,然后在水中自组装形成mPEG10-MMB前药纳米颗粒,当mPEG10-MMB前药纳米颗粒进入肿瘤细胞后,在肿瘤细胞的酸性环境中,酯键降解并释放出MMB,从而有效杀死肿瘤细胞。

    图  1  两亲性前药mPEG10-MMB的合成、自组装及药物输送

    Figure 1.  Synthesis, self-assembly and drug delivery of amphiphilic mPEG10-MMB prodrug

    • 4-二甲氨基吡啶(DMAP,纯度99%)、二环己基碳二亚胺(DCC,纯度99 %)、尼罗红(NR,纯度99%):均购自百灵威(J&K)试剂公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT):纯度99%,购自西格玛(Sigma)试剂公司;羟甲基小白菊内酯:上海市第六人民医院药剂科提供;羧基聚乙二醇单甲醚(mPEG10-COOH):Mn = 550,Mw/Mn <1.05,购自上海炎怡生物科技有限公司;二氯甲烷(DCM):购自上海阿拉丁(Aladdin)生化科技股份有限公司;二甲基亚砜(DMSO)、无水硫酸钠:购自国药集团化学试剂有限公司;人宫颈癌细胞(HeLa细胞):购自中国科学院上海生物科学研究所;胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、磷酸盐缓冲液(PBS,pH = 7.4)、多聚甲醛:购自PAA公司;透析袋(Mw = 1 000)购自绿鸟科技有限公司。

    • 采用Varian公司Mercury plus-400型核磁共振波谱仪测试样品的核磁共振氢谱,测试温度25 °C,溶剂CDCl3,内标三甲基硅烷(TMS);采用Waters科技有限公司Q-TOF Premier型超高分辨液相色谱-质谱(LC-MS)联用仪分析测试样品分子量,洗脱剂为乙腈-超纯水(体积比为1∶1);采用珀金埃尔默有限公司Lam UV-Vis型紫外-可见分光光度计测试样品紫外光谱,测试温度25 °C,扫描波长范围200~650 nm,速率为480 nm/min;采用英国马尔文仪器有限公司Zetasizer Nano ZS型动态光散射(DLS)分析仪测试前药纳米颗粒粒径,测试温度25 °C,散射角90°;采用日本电子株式会社JEOL JEM-CX-II透射电子显微镜(TEM)测试前药纳米颗粒形貌,加速电压为200 kV;采用美国BD公司LSRFortessa流式细胞仪记录细胞摄取数据;采用德国徕卡(Leica)公司TCS SP8 STED 3X活细胞超高分辨率多光子激光共聚焦显微镜拍摄前药纳米颗粒进细胞图像。

    • mPEG10-MMB两亲性前药由mPEG10-COOH与MMB通过酯化反应合成得到,具体制备过程如下:在50 mL单口圆底烧瓶中,依次加入mPEG10-COOH(208 mg,0.378 mmol)、DCC(93.6 mg,0.454 mmol)和10 mL无水二氯甲烷,0°C下搅拌30 min使固体全部溶解。然后,将5 mL溶有MMB(50 mg,0.190 mmol)和DMAP(51.7 mg,0.423 mmol)的二氯甲烷溶液加入上述烧瓶中,室温下避光反应48 h。反应结束后,过滤除去白色沉淀,滤液用旋转蒸发仪除去有机溶剂得到固体粗产物。粗产物用二氯甲烷重新溶解、过滤并收集滤液。滤液用去离子水洗涤2次,饱和NaHCO3溶液洗涤1次,再用去离子水洗涤1次,最后加入无水Na2SO4干燥过夜。过滤除去Na2SO4,收集有机层并浓缩得到固体。将固体溶于少量DMSO并转移至透析袋中,用去离子水透析24 h,透析液经冷冻干燥得到白色固体产物102.3 mg(产率43 %)。1H-NMR(400 MHz,CDCl3δ:6.24 (s,1H),6.24 (s,1H),5.57 (t,1H),4.70 (s,1H),4.49 (s,1H),4.25 (d,2H),3.85 (s,2H),3.64 (m,101H),3.56 (s,3H),3.38 (s,3H),2.85 (s,2H),2.64 (d,J = 14.3 Hz,5H),2.42 (m,2H),2.22 (s,7H),1.55 (s,4H),1.25 (s,16H),1.12 (s,4H),0.87 (s,2H)。

    • 称取5 mg mPEG10-MMB溶于1 mL DMSO中,采用微量注射泵以0.8 mL/h滴加速率将该溶液缓慢滴加到4 mL搅拌的超纯水中。滴加完毕后,将组装体溶液转移至透析袋中进行透析,每4 h更换一次去离子水,共透析24 h。透析结束后,测得组装体溶液体积为15 mL,浓度为0.33 mg/mL。

    • 将5 mg mPEG10-MMB溶于1 mL DMSO中,然后加入0.2 mL质量浓度为0.4 mg/mL NR DMSO溶液,室温振荡2 min。采用微量注射泵以0.8 mL/h滴加速率将上述溶液缓慢滴加到4 mL搅拌的超纯水中,滴加完毕后,将组装体溶液转移到透析袋中,用去离子水透析24 h,每4 h换1次去离子水。透析结束后,得到负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒溶液。

    • mPEG10-MMB前药在在水中形成纳米颗粒的临界胶束浓度(CMC)采用尼罗红荧光探针法测定。将10 μL NR丙酮溶液(浓度为2 × 10-4 mol/L)加入1 mL不同浓度梯度的mPEG10-MMB前药水溶液中,室温搅拌过夜,使丙酮完全挥发,NR的终浓度为2 × 10-6 mol/L,而mPEG10-MMB前药的质量浓度为0.005~200 μg/mL。采用LS-50B型荧光光谱仪测定不同浓度mPEG10-MMB水溶液的荧光光谱,激发波长设为550 nm,光栅宽带为10 nm。记录不同mPEG10-MMB前药浓度水溶液荧光光谱中NR的最大荧光发射强度,并以最大荧光发射强度对mPEG10-MMB前药的对数浓度作图,曲线拐点对应的浓度即为mPEG10-MMB前药在水中的CMC。

    • 采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测HeLa细胞对mPEG10-MMB前药纳米颗粒的摄取情况。

      流式细胞仪测试:将HeLa细胞以每孔5.0 × 105个的密度铺入在6孔板中,在CO2培养箱中孵育24 h。细胞贴壁后,去除培养基,加入2 mL负载NR(NR质量浓度为2.5 μg/mL)的mPEG10-MMB前药纳米颗粒的无血清DMEM溶液,继续在CO2培养箱中分别孵育1、2、4 h之后,除去培养基,用冷PBS洗涤3次。使用胰蛋白酶消化细胞并收集于流式管中。采用BD LSRFortessa流式细胞仪收集并分析门内1.0 × 104个细胞的荧光数据。

      激光共聚焦显微镜测试:将直径为20 mm的圆形盖玻片置于6孔板中,然后将HeLa细胞以每孔5.0 × 105个细胞的浓度接种到6孔板中。24 h后,吸取培养基,加入1 mL负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒的无血清DMEM溶液,纳米颗粒的浓度为30 μmol/L,继续培养4 h后除去DMEM培养基,用冷PBS洗涤3次,每次漂洗5 min,随后加入w=4%的多聚甲醛固定细胞,室温下避光30 min。细胞固定好后,吸去多聚甲醛,并用冷PBS漂洗3次。然后加入1 mL DAPI染液(2 μg/mL),室温下避光染色10 min。染色结束后,除去DAPI染液,用冰PBS洗涤3次,每次5 min,最后再用超纯水漂洗一遍。将一侧有细胞的盖玻片覆盖在滴有少量抗荧光淬灭剂的载玻片上固定,避光保存样品,采用激光共聚焦显微镜直接观察。

    • 通过MTT法分别测定了mPEG10-MMB前药纳米颗粒对正常细胞和肿瘤细胞的毒性。

      选用BRL-3A细胞株,研究mPEG10-MMB前药纳米颗粒对正常细胞的毒性。首先将BRL-3A细胞按每孔5 × 103个细胞的密度,将正常细胞接种在96孔板中,置于体积分数为5%的CO2和37 °C培养箱中培养24 h。细胞贴壁后,更换新的培养基,设定不同浓度梯度的mPEG10-MMB前药纳米颗粒(0.1~100 μmol/L)溶液,细胞在培养箱中培养72 h。每个孔中加入20 μL MTT的PBS溶液(5 mg/mL)。避光培养4 h后,除去含有未反应MTT的培养基,随后每孔中加入200 μL DMSO,振荡10 min充分溶解蓝紫色结晶甲臜,用BIO-RAD Model 680酶标仪在490 nm处测量每个孔的吸光度值存活率(CS)由一下公式计算得到:

      公式中:As—实验组吸光度值(含有细胞的培养基,MTT,药物);Ab—空白对照组吸光度值(不含有细胞和药物的培养基,MTT);Ac—阴性对照组吸光度值(含有细胞的培养基,MTT,没有加药的);其中,空白对照组细胞存活率设定为100%。

      选用HeLa细胞株,研究mPEG10-MMB前药纳米颗粒对肿瘤细胞的毒性,具体操作步骤同上。

    • MMB、mPEG10-COOH、mPEG10-MMB的1H-NMR谱图见图2。比较图2中的核磁共振氢谱可以看出,酯化反应产物中同时出现了原料mPEG10-COOH和MMB的特征峰,其中MMB的羟基与mPEG10-COOH的羧基反应形成酯键后,其临近亚甲基上质子信号峰的化学位移从4.14(1)移动到4.69(1'),而MMB中双键的质子信号峰仅从化学位移6.23(2)略微移动至6.24(2'),这是由于其远离酯化反应位点,故化学位移变化不明显。同时,化学位移在3.50-3.70和3.33分别属于mPEG10-COOH中重复单元-CH2-CH2O-和末端单元-OCH3的特征信号峰(b+c)和(a),在mPEG10-MMB的1H-NMR谱图中也相应出现(b'+c')和(a'),且化学位移基本保持不变。可见,成功本文合成了mPEG10-MMB前药。

      图  2  样品的1H-NMR谱

      Figure 2.  1H-NMR spectra of samples

      细胞存活率由以下公式计算得到:细胞存活率 = (实验组A值-空白对照A值)/(阴性对照组A值-空白对照A值)×100%,其中空白对照组细胞存活率设置为100%。

      两亲性前药mPEG10-MMB以及原料mPEG10-COOH的液相色谱-质谱联用(LC-MS)对,结果如图3所示。mPEG10-COOH和mPEG10-MMB的LC-MS谱图中均出现了一系列不同Mn信号峰和对应的保留时间,相邻的峰与峰之间Mn之差为44,与PEG中重复单元(-CH2-CH2-O-)的分子量一致,说明mPEG10-COOH的Mn存在一定分布。根据mPEG10-MMB前药合成反应方程式,原料与产物的m/z应满足如下关系式:M(mPEG10-MMB)= M(mPEG10-COOH) + M(MMB) - 18,即前药mPEG10-MMB与原料mPEG10-COOH的Mn之差应接近MMB的Mn264。从图3中对应的Mn信号峰可看出,mPEG10-MMB的Mn比mPEG10-COOH的Mn多出262.14,与上述理论公式计算出的结果基本一致,进一步证明mPEG10-MMB前药的成功合成。

      图  3  mPEG10-COOH和mPEG10-MMB前药的LC-MS谱图

      Figure 3.  LC-MS spectra of mPEG10-COOH and mPEG10-MMB prodrug

      mPEG10-MMB前药在乙腈中的UV-Vis光谱如图4所示。从图中可以看出,原料MMB的吸收峰位于226 nm处,mPEG10-COOH的吸收峰位于208 nm处,而mPEG10-MMB前药出现了两个吸收峰,分别位于286 nm处和206 nm处,也从另一个角度证明mPEG10-MMB前药的成功合成。

      图  4  mPEG10-COOH、MMB和mPEG10-MMB前药的UV-Vis谱图

      Figure 4.  UV-Vis spectra of mPEG10-COOH, MMB and mPEG10-MMB prodrug (ρ (sample) = 20 μg/mL)

    • 分别采用DLS和TEM对mPEG10-MMB前药在水中自组装得到的组装体的表征结果如图5所示。从图5(a)的DLS结果可以看出,mPEG10-MMB前药可在水中自组装形成平均粒径为120.3 nm,粒径分布为0.207的聚集体。而从图5(b)的TEM照片可以看出,mPEG10-MMB前药在水中自组装形成的聚集体为平均粒径约108.5 nm的球形纳米颗粒。TEM测得的平均粒径比DLS的小了约11.8 nm,这是由于TEM测试中样品处于干态,而DLS测试样品处于湿态所致。

      图  5  mPEG10-MMB前药纳米颗粒的DLS曲线(a)和TEM照片(b)

      Figure 5.  DLS curve (a) and TEM image (b) of mPEG10-MMB prodrug nanoparticles

    • 水溶液中NR的最大荧光发射强度与mPEG10-MMB前药质量浓度的关系如图6所示。在550 nm的激发光下,当mPEG10-MMB的质量浓度较低时,NR的最大荧光发射强度较弱且几乎保持不变,说明只有少量的疏水性NR分子分散在水相中。当mPEG10-MMB前药质量浓度继续增加时,NR的最大荧光发射强度突然增加,快速达到NR分子完全处于疏水环境中的数值。NR的最大荧光发射强度发生突变说明,mPEG10-MMB前药在水中发生微相分离,形成了一定的疏水微区(即自组装形成了胶束)。根据图6中曲线的拐点,可以得到mPEG10-MMB前药的CMC约为7.7 μg/mL。

      图  6  水溶液中NR的最大荧光发射强度与mPEG10-MMB前药浓度的关系

      Figure 6.  Maximum emission intensity of NR versus the concentration of mPEG10-MMB

    • 选用HeLa细胞对mPEG10-MMB前药纳米颗粒的细胞内摄情况进行研究。由于mPEG10-MMB前药纳米颗粒自身没有荧光,故选用NR作为荧光探针并将其负载到mPEG10-MMB前药纳米颗粒中,然后与HeLa细胞共同孵育指定时间并采用流式细胞仪进行分析,结果如图7所示。从图中可以看出,HeLa细胞内的NR荧光强度随着孵育时间的增加而变强,这说明随着负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒与HeLa细胞孵育时间的增加,越来越多的负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒进入HeLa细胞内,导致其荧光强度增强。

      图  7  流式细胞仪测得的与封装NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒孵育不同时间后HeLa细胞内的几何平均荧光强度(插图为未处理的HeLa细胞(a)和与封装NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒培养4 h后的Hela细胞(b)分别测得的流式细胞曲线)

      Figure 7.  Time-dependent profiles of NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles fluorescence intensity in HeLa cells by flow cytometry analysis (Insert: representative flow cytometry histogram profiles of HeLa cells cultured with NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles for 4 h, the untreated cells are used as a control)

      Hela细胞与负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒一起培养4 h,并用DAPI对细胞核染色,然后进行CLSM测试,结果如图8所示(其中:微分干涉差(DIC)图为原始Hela细胞照片,DAPI图为染色的Hela细胞核照片,NR图为负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒与Hela细胞共培养后的照片,叠加(Merge)图为DAPI和NR照片的叠加图)。从Merge图中可以看出,负载NR的mPEG10-MMB前药纳米药颗粒中NR的红色荧光同时出现在细胞质和细胞核中,说明负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒可被癌细胞有效摄取。流式细胞仪和CLSM的测试结果都表明mPEG10-MMB前药纳米颗粒能有效进入肿瘤细胞中。

      图  8  负载NR的mPEG10-MMB前药纳米颗粒与HeLa细胞培养4 h的激光共聚焦显微镜照片(细胞核用DAPI染色)

      Figure 8.  CLSM images of HeLa cells incubated with NR-loaded mPEG10-MMB prodrug nanoparticles for 4 h (Cell nuclei are stained with DAPI)

    • 采用MTT法评估了mPEG10-MMB前药纳米颗粒对HeLa细胞增殖的抑制效果。MTT法又称MTT比色法,常用来检测细胞存活率和生长,其基本原理是活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将MTT还原为水中不溶解的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积于细胞中,而死细胞却没有这种功能。用DMSO溶解细胞中生成的甲瓒得到的蓝紫色溶液,其在490 nm波长处有特定吸收,用酶联免疫检测仪测定该波长处的光吸收值,即可间接反映出活细胞的数量。在一定的细胞数量范围内,MTT结晶形成的蓝紫色甲瓒量与活细胞数成正比。分别将MMB和mPEG10-MMB前药纳米颗粒与HeLa细胞培养72 h后,用MTT法测得细胞毒性,结果如图9所示。从图中可以看出,mPEG10-MMB前药纳米颗粒对HeLa生长的抑制效果明显优于MMB,它们的半抑制浓度值分别为13 μmol/L和24 μmol/L,这是由于mPEG10-MMB前药纳米颗粒具有被动靶向作用,可被癌细胞内吞并在癌细胞内富集,由于癌细胞内环境呈微酸性,促使mPEG10-MMB前药中的酯键降解,释放出MMB,从而有效抑制肿瘤细胞的增殖。

      图  9  MTT法测得的MMB和mPEG10-MMB前药纳米颗粒对HeLa细胞的细胞毒性

      Figure 9.  In vitro cytotoxicity of MMB and mPEG10-MMB prodrug nanoparticles to HeLa cells determined by MTT assay

    • 采用大鼠正常肝细胞BRL-3A细胞,通过MTT实验评价了mPEG10-MMB前药纳米颗粒对正常细胞的毒性。BRL-3A正常细胞的存活率与mPEG10-MMB前药纳米颗粒浓度的关系曲线如图10所示。随着mPEG10-MMB纳米颗粒浓度的提高,BRL-3A细胞的存活率虽有一定程度的下降,但相比于相同药物浓度下HeLa肿瘤细胞的存活率,其仍要高出2倍左右。例如当mPEG10-MMB前药纳米颗粒浓度为100 μmol/L时,BRL-3A正常细胞的存活率约为60%,而HeLa肿瘤细胞的存活率仅约为20%不到。由此可见,mPEG10-MMB前药纳米颗粒在有效抑制肿瘤细胞的同时,对正常细胞毒性则相对较低,具有潜在的临床应用前景。

      图  10  MTT法测得mPEG10-MMB前药纳米颗粒对BRL-3A细胞的毒性

      Figure 10.  In vitro cytotoxicity of mPEG10-MMB prodrug nanoparticles to BRL-3A cells determined by MTT assay

    • (1)通过mPEG10-COOH与MMB之间的一步酯化反应偶联得到两亲性前药mPEG10-MMB。

      (2)两亲性前药mPEG10-MMB可在水中自组装形成纳米颗粒,可实现MMB的被动靶向输送。

      (3)mPEG10-MMB前药纳米颗粒可通过内吞方式被肿瘤细胞摄取。

      (4)与MMB小分子药相比,mPEG10-MMB前药纳米颗粒对HeLa肿瘤细胞增殖具有更好的抑制作用,同时,对正常细胞的毒性相对较低。

参考文献 (24)

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