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电泳沉积技术制备纳米铜-海藻酸钙复合抗菌膜

雷雨 屈雪

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电泳沉积技术制备纳米铜-海藻酸钙复合抗菌膜

    作者简介: 雷 雨(1993—11),男,硕士,助研,主要研究方向为大分子电沉积技术。E-mail:leiyuchou@126.com.
    通讯作者: 屈雪, quxue@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R318.08

A Copper Nanoparticles – Calcium Alginate Composite Bactericidal Film Prepared by Electrophoretic Deposition Technique

    Corresponding author: QÜ Xue, quxue@ecust.edu.cn
  • CLC number: R318.08

  • 摘要: 通过调节电解液中纳米铜的含量,经电泳沉积得到海藻酸钙-纳米铜新型抗菌纳米复合膜(Ca2+-Alg-Cu)。以扫描电子显微镜(SEM)、能谱仪(EDS)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征了Ca2+-Alg-Cu的结构。使用稀释涂板法研究了Ca2+-Alg-Cu对大肠杆菌(E. coli.)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和绿脓杆菌(P. aeruginosa)的抗菌性能。使用小鼠L929成纤维细胞与Ca2+-Alg-Cu共培养表征了其细胞相容性。结果表明,Ca2+-Alg-Cu能够通过破坏细菌形貌,高效杀死上述3种细菌;Ca2+-Alg-Cu对细胞存活率的影响主要依赖电解液中纳米铜的质量浓度,当其不高于0.4 mg/mL时,细胞存活率大于80%,能够兼顾高效杀菌活性和良好的生物相容性。
  • 图 1  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的照片

    Figure 1.  Photograph of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

    图 2  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的SEM照片

    Figure 2.  SEM images of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

    图 3  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的EDS图谱

    Figure 3.  EDS Graph of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

    图 4  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的红外吸收光谱

    Figure 4.  FT-IR spactra of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

    图 5  Ca2+-Alg-Cu系列膜在37 ℃ E. Coli菌液中的颜色变化

    Figure 5.  Color fading of Ca2+-Alg-Cu films in E. Coli suspension at 37 ℃

    图 6  Ca2+-Alg-Cu与高浓度(1×107 CFU/mL)E. coli共培养后的菌落

    Figure 6.  E. coli colony after high turbidity(1×107 CFU/mL)bacterial suspension treated with Ca2+-Alg-Cu films

    图 7  用高浓度(1×107 CFU/mL)大肠杆菌与Ca2+-Alg-Cu共培养2 h的细菌存活率柱形图

    Figure 7.  Surviving rates of E. coli in high initial turbidity(1×107 CFU/mL)after treatment with Ca2+-Alg-Cu films for 2 h

    图 8  用低浓度(1×106 CFU/mL)细菌与Ca2+-Alg-Cu共培养2 h的细菌存活率柱形图

    Figure 8.  Surviving rates of bacteria in low initial turbidity(1×106 CFU/mL)after treatment with Ca2+-Alg-Cu films for 2 h

    图 9  Ca2+-Alg-Cu50处理E.coliS.aureus前(a, c)和处理2 h后(b, d)的SEM照片

    Figure 9.  SEM images of E. coli and S. aureus before(a, c)and after(b, d)2 h of Ca2+-Alg-Cu50 treatment

    图 10  Ca2+-Alg-Cu与小鼠L929细胞共培养后的细胞存活率柱形图

    Figure 10.  Surviving rates of mice fibroblasts L929 cultured with Ca2+-Alg-Cu

    表 1  海藻酸钙-纳米铜电解液配方

    Table 1.  Composition of calcium alginate-copper nanoparticles electrolyte

    m/mgCa2+-AlgCa2+-Alg-Cu10Ca2+-Alg-Cu20Ca2+-Alg-Cu50
    CaCO3500490480450
    Cu NPs0102050
    m(Alg)=1 g, V(H2O)=50 mL
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    表 2  与Ca2+-Alg-Cu共培养的大肠杆菌存活率与小鼠成纤维L929细胞存活率

    Table 2.  Viabilities of E.coli and mice fibroblasts L929 after incubation with Ca2+-Alg-Cu

    Viability/%E.coliL929 Fibroblast
    Ca2+-Alg108 ± 4100 ± 2
    Ca2+-Alg-Cu1018 ± 196 ± 4
    Ca2+-Alg-Cu207 ± 180 ± 3
    Ca2+-Alg-Cu501 ± 139 ± 8
    t=24 h
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-15
  • 网络出版日期:  2019-12-02

电泳沉积技术制备纳米铜-海藻酸钙复合抗菌膜

    通讯作者: 屈雪, quxue@ecust.edu.cn
    作者简介: 雷 雨(1993—11),男,硕士,助研,主要研究方向为大分子电沉积技术。E-mail:leiyuchou@126.com
  • 华东理工大学材料科学与工程学院,教育部医用生物材料工程研究中心 上海 200237

摘要: 通过调节电解液中纳米铜的含量,经电泳沉积得到海藻酸钙-纳米铜新型抗菌纳米复合膜(Ca2+-Alg-Cu)。以扫描电子显微镜(SEM)、能谱仪(EDS)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征了Ca2+-Alg-Cu的结构。使用稀释涂板法研究了Ca2+-Alg-Cu对大肠杆菌(E. coli.)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和绿脓杆菌(P. aeruginosa)的抗菌性能。使用小鼠L929成纤维细胞与Ca2+-Alg-Cu共培养表征了其细胞相容性。结果表明,Ca2+-Alg-Cu能够通过破坏细菌形貌,高效杀死上述3种细菌;Ca2+-Alg-Cu对细胞存活率的影响主要依赖电解液中纳米铜的质量浓度,当其不高于0.4 mg/mL时,细胞存活率大于80%,能够兼顾高效杀菌活性和良好的生物相容性。

English Abstract

  • 随着耐药性细菌的出现,传统的抗菌手段已面临十分严峻的挑战[1, 2]。目前,新型抗菌材料的研究和产品开发,主要围绕抗菌肽和金属离子展开。大多数抗菌肽通过高选择性和特异性靶向细胞质组分和干扰细胞代谢来发挥作用,但是抗菌肽生产成本高,体内稳定性差。许多金属纳米粒子被发现具有高效抗菌性能[3, 4],比如银和铜。尽管银抗菌活性强,但是作为外来重金属,它的远期生物安全性一直为人们所担忧[5]。铜是生物体生理学和基础代谢的必需微量元素[6],人体每天需要摄入1 mg左右的铜元素。铜是众多生物体内酶的结构组分和催化中心,比如皮肤中的超氧化物歧化酶依赖于铜。铜还能加速上皮组织生长,诱导血管内皮生长因子促进成血管化[6]

    铜对各种真菌、寄生虫、甚至病毒都具有杀灭性[6]。主要的作用机理有Cu2+和Cu+的氧化还原循环能催化羟基自由基的生成(局部芬顿(Fenton)反应),进而对细菌膜脂质、DNA进行超氧化破坏[7];Cu2+能插入DNA的胞嘧啶-鸟嘌呤(G-C)碱基对,破坏氢键;Cu2+特异性攻击蛋白质双功能酪氨酸磷酸酶(VHR),氧化其半胱残基,同时还攻击细菌蛋白质和多肽链中的组氨酸、脯氨酸,消耗细菌细胞膜中的还原性谷胱甘肽[7];Cu2+也与细菌表面的负电区域发生静电作用,选择性地撕裂菌膜表面[7]

    目前,有很多学者研究了铜的不同化学形式产生的抗菌效果,包括纯铜[7]、铜合金(如黄铜)[7, 8]、铜离子[9]、难溶铜盐[10]、铜离子配合的杂环化合物[11]、纳米铜[12-14]、纳米氧化铜[15-17]、硫化铜纳米量子点[18]、纳米铜-镍合金[19]、含Cu2+的纳米壳聚糖凝胶[20]、嵌入纳米铜的海泡石微球[21]、含铜的纳米硅球[22]、铜离子螯合的天然染料[23-26]、嵌入纳米氧化铜的纤维织品[6, 27]等。张俐娜课题组[28]制备了纳米铜涂覆的纤维素膜具有高效的抗菌活性。Villanueva等[29]合成了氧化硅包覆的纳米铜并保持了连续4个循环的抗菌活性。

    虽然上述工作使用铜作为抗菌功能组分,但是制备方法复杂、耗时。因此本文拟将纳米铜引入海藻酸钙凝胶膜中,利用纳米铜的抗菌功能,使创口敷料获得抗菌活性。具体借助电化学沉积技术,以碳酸钙-海藻酸(Alg)-纳米铜混合体系为电解液主要成分,在阳极诱导海藻酸钙-纳米铜复合膜(Ca2+-Alg-Cu)的形成。对膜的表观形貌、化学结构、抗菌性能和体外细胞相容性做了初步研究和分析。

    • 海藻酸钠:分析纯,上海阿拉丁化学试剂有限公司;纳米铜(Cu, < 50 nm)、噻唑兰(MTT):分析纯,Sigma-Aldrich化学品公司;氯化钠、碳酸钙、十二水合磷酸氢二钠、一水合磷酸二氢钾、二甲基亚砜(DMSO):分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司;杜尔贝科的改良伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青链霉素溶液、胰蛋白酶:生物试剂纯度,Hyclone生物试剂有限公司。

      冷冻干燥机:中国宁波新芝生物科技公司Scientz-10N型;电化学工作站:中国上海辰华仪器公司CHI 660E型;铂片电极:中国上海辰华仪器公司,15 mm×15 mm×0.2 mm;Ag/AgCl电极:中国上海辰华仪器公司CHI 111型;铂丝电极:中国上海辰华仪器公司CHI 115型;高压灭菌锅:中国上海申安医疗机械厂LDZX-50KBS型;细胞培养箱:美国赛默飞世尔科技公司SERIES 8000W型;酶标仪:美国分子器械公司SPECTRA max 384型;扫描电子显微镜(SEM):日本日立公司S4800型,喷金40 s,电压10 kV;能谱仪(EDS):牛津仪器Ultim,EXTREME无窗型电制冷,100 mm2SDD探测器、定性定量分析导航器,分辨率优于127 eV,可测元素范围3Li-92U;傅里叶变换红外光谱(FT-IR):美国热电公司Nicolet 5700型,测定波数范围为650~4 000 cm−1

    • 各样品按表1成份配制电解液,将电解液搅拌10 min后放入超声机中超声处理5 min,使纳米铜充分分散,再继续搅拌10 min。将上述混合液倒入50 mL烧杯,打开电化学工作站,用3电极体系(阴极和阳极都是铂片电极,电极尺寸为15 mm ×15 mm × 0.2 mm,参比电极是Ag/AgCl电极)以恒电流模式进行电泳沉积,电流密度为4.44 mA/cm2,通电电量是1.8 C。沉积结束后,用去离子水冲洗沉积的纳米铜膜,用镊子把膜剥离下来,并放在干净的培养皿中,放入冷冻干燥机中干燥24 h后,置于干燥器或者冰箱冷藏室中待用。

      m/mgCa2+-AlgCa2+-Alg-Cu10Ca2+-Alg-Cu20Ca2+-Alg-Cu50
      CaCO3500490480450
      Cu NPs0102050
      m(Alg)=1 g, V(H2O)=50 mL

      表 1  海藻酸钙-纳米铜电解液配方

      Table 1.  Composition of calcium alginate-copper nanoparticles electrolyte

    • 用生理盐水将菌液梯度稀释至约107或106 CFU/mL,24孔板每孔加入1 mL菌液和Ca2+-Alg或Ca2+-Alg-Cu膜,以只加入1 mL菌液的样品为空白对照,放入37 ℃恒温培养箱内共培养12 h。用生理盐水将共培养菌液梯度稀释,取100 μL菌液滴在固体琼脂平板上,轻轻震荡使菌液均匀铺满平板,将平板放入37 ℃恒温培养箱内培养15 h,记录形成的菌落数,计算杀菌率,每组样品设置3个平行样。

    • 将空白对照组菌液和与Ca2+-Alg或Ca2+-Alg-Cu共培养12 h的菌液(1 mL)高速离心,去除500 μL上清液,加入1 mL w=2.5%的戊二醛溶液,静置固定2~3 h。高速离心5 min,去除部分上清液,加入1 mL w=30%的酒精,静置10 min后再高速离心5 min,依次用w= 50%、75%、85%、90%和100%的酒精进行10 min梯度脱水,最后加入乙酸异戊酯置换酒精。将脱水后的菌液滴在硅片上,放入冷冻干燥机中冻干24 h。将硅片黏在导电胶上,通过SEM观察细菌形貌。

    • 小鼠成纤维细胞(L929)以每孔2×104 cells的细胞密度接种到12孔板后,把孔板放到细胞培养箱24 h后至细胞贴壁。而后在培养孔中加入新鲜制备的Ca2+-Alg-Cu,培养24 h后,去除材料,在避光条件下向每孔加入200 μL噻唑兰溶液,把孔板放回细胞培养箱4 h后,吸取上清液,向每孔加入1 mL DMSO,37 ℃恒温箱中培养10 min使紫色结晶完全溶解,吹打均匀后取100 μL溶液至96孔板,放入酶标仪用492 nm的波长测定吸光度。实验数据用OriginLab作图。每组设置3个平行样。

    • 阳极沉积形成的膜如图1所示。Ca2+-Alg呈白色,而Ca2+-Alg-Cu10,Ca2+-Alg-Cu20和Ca2+-Alg-Cu50呈现逐渐变深的绿色,可能是由于纳米铜的加入能够增加材料的折射率,使膜颜色逐渐加深,也可以据此定性判断出纳米铜含量在各种膜中的变化。

      图  1  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的照片

      Figure 1.  Photograph of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

      图2是Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu的SEM表面形貌。随着Cu含量的增加,Ca2+-Alg-Cu表面的粗糙度逐渐增加,纳米团簇的密度越来越高,表面的颜色越来越暗。同时一些不光滑,褶皱和类似气泡结构的出现,可能是在阳极附近由于水的电解产生了氧气,同时碳酸钙溶解时释放出一些CO2,两种气体同时在电极附近存在,使沉积出来的样品膜出现气泡样形貌。

      图  2  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的SEM照片

      Figure 2.  SEM images of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

    • 能谱仪EDS元素分析的结果如图3所示。可以看出,只有加入纳米铜的实验组出现了铜元素的峰,说明纳米铜成功地包入了海藻酸钙膜。而且,随着纳米铜含量的增加,Cu元素信号峰的强度增强。

      图  3  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的EDS图谱

      Figure 3.  EDS Graph of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

      Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu的红外谱图如图4所示。图中1 597 cm−1处的峰对应COO的不对称拉伸振动,1 410 cm−1处的峰对应COO的对称拉伸振动,1 300 cm−1处的峰对应C―O(H)键,1 120 cm−1处的峰对应C―C的拉伸振动,1 084 cm−1处的峰对应古罗糖醛酸中C―O的拉伸振动,1 030 cm−1处的峰对应―C―O―C―基团,935 cm−1处的峰对应古罗糖醛酸中受到C―C―H和C―O―H形变影响的C―O键,887 cm−1对应甘露糖醛酸中的C―C―O和C―O―C基团,810 cm−1对应甘露糖醛酸中的C―O基团,776 cm−1对应C−H键的平面外弯曲振动。

      图  4  Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu系列膜的红外吸收光谱

      Figure 4.  FT-IR spactra of Ca2+-Alg and Ca2+-Alg-Cu films

      可以看到随着纳米铜含量的增加,1 597 cm−1处COO的不对称伸缩振动峰强度和1 410 cm−1处对称伸缩振动峰强度都在减弱,说明纳米铜会与海藻酸钙中的羧酸根离子COO相互作用,从而弱化信号峰的强度。同时,1 300 cm−1处C―O(H)键的信号峰也随着纳米铜含量的增加逐渐消失,说明纳米铜也会与海藻酸钙中的羟基相互作用。值得注意的是,1 030 cm−1处的―C―O―C―键的红外吸收峰强度随着加入纳米铜含量的增加而减弱,说明纳米铜除了可以与海藻酸钙中的羟基和羧基反应外,还可以与醚键发生相互作用。最后,887 cm−1处甘露糖醛酸中的C―C―O和C―O―C基团的吸收峰强度随着膜中纳米铜含量的增加而减弱,说明纳米铜主要与海藻酸钙中的甘露糖醛酸链段发生反应,而基本不与海藻酸钙中的古罗糖醛酸链段反应,说明古罗糖醛酸链段主要用于和碳酸钙解离出的钙离子发生离子交联反应,形成鸡蛋盒子结构,而未参与离子交联的甘露糖醛酸链段参与了和纳米铜的相互作用。

    • 将大肠杆菌(E. coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)分别作为革兰氏阴性菌模型和革兰氏阳性菌模型,细菌浓度为1×107 CFU/mL。细菌与Ca2+-Alg、Ca2+-Alg-Cu共培养2 h后的膜片颜色变化如图5所示。经过2 h的培养后,Ca2+-Alg-Cu的绿色逐渐褪去变成白色,说明原本包在Ca2+-Alg-Cu中的铜纳米颗粒逐渐释放到菌液里。

      图  5  Ca2+-Alg-Cu系列膜在37 ℃ E. Coli菌液中的颜色变化

      Figure 5.  Color fading of Ca2+-Alg-Cu films in E. Coli suspension at 37 ℃

      细菌生长情况如图6所示,空白对照组和Ca2+-Alg都不能抑制细菌的生长,而Ca2+-Alg-Cu中,随着纳米铜组分的增加,抗菌效果逐渐增强,说明纳米铜对细菌的生长和繁殖具有显著的抑制作用。

      图  6  Ca2+-Alg-Cu与高浓度(1×107 CFU/mL)E. coli共培养后的菌落

      Figure 6.  E. coli colony after high turbidity(1×107 CFU/mL)bacterial suspension treated with Ca2+-Alg-Cu films

      图6中的菌落数转换为细菌存活率柱状图,见图7。可以看出,Ca2+-Alg-Cu的杀菌活性随着其中Cu的含量增加而增加,Ca2+-Alg-Cu50的杀菌率高达100%。

      图  7  用高浓度(1×107 CFU/mL)大肠杆菌与Ca2+-Alg-Cu共培养2 h的细菌存活率柱形图

      Figure 7.  Surviving rates of E. coli in high initial turbidity(1×107 CFU/mL)after treatment with Ca2+-Alg-Cu films for 2 h

      采用低浓度(1×106 CFU/mL)3种常见细菌,E.coliS. aureus和绿脓杆菌(P. aeruginosa)测试Ca2+-Alg-Cu的抗菌活性的实验结果见图8。结果表明,即使是Ca2+-Alg-Cu10也能产生约100%的杀菌效率,这种材料对常见细菌具有高效广谱杀菌性能。

      图  8  用低浓度(1×106 CFU/mL)细菌与Ca2+-Alg-Cu共培养2 h的细菌存活率柱形图

      Figure 8.  Surviving rates of bacteria in low initial turbidity(1×106 CFU/mL)after treatment with Ca2+-Alg-Cu films for 2 h

    • 图9为用扫描电镜SEM观察与Ca2+-Alg-Cu50共培养2 h后的细菌形貌。E. coliS. aureus外形严重变形,表面出现褶皱,说明Ca2+-Alg-Cu50在杀菌过程中也会改变细菌形貌。

      图  9  Ca2+-Alg-Cu50处理E.coliS.aureus前(a, c)和处理2 h后(b, d)的SEM照片

      Figure 9.  SEM images of E. coli and S. aureus before(a, c)and after(b, d)2 h of Ca2+-Alg-Cu50 treatment

    • 体外细胞相容性实验结果如图10所示。随着纳米铜比重的增加,细胞存活率逐渐降低。Ca2+-Alg和Ca2+-Alg-Cu10处理的小鼠成纤细胞L929存活率均高于80%,分别为98%和83%,而在Ca2+-Alg-Cu20和Ca2+-Alg-Cu50处理组,小鼠细胞存活率低于80%,分别为75%和40%,经过24 h的处理小鼠L929细胞的有效线粒体数随着膜中纳米铜含量的增加而降低,意味着存活状态细胞比例在降低,细胞毒性逐渐增加。表2为高浓度E. coli与材料共培养的数据与细胞存活率。由表可以见到,Ca2+-Alg对E. coli没有抑菌作用,而细胞生长很好,存活率为100%。相反,与Ca2+-Alg-Cu50共培养24 h后,细胞存活率只有40%,而杀菌率达到100%。中间两组中,Ca2+-Alg-Cu20能够实现高杀菌作用和可接受的小鼠成纤维细胞相容性,Ca2+-Alg-Cu10能够实现部分杀菌和优异的小鼠成纤维细胞相容性,说明纳米铜的加入在增强材料杀菌作用的同时会干扰细胞的正常生长,因此需要仔细考量抗菌作用和细胞生长间的关系。

      图  10  Ca2+-Alg-Cu与小鼠L929细胞共培养后的细胞存活率柱形图

      Figure 10.  Surviving rates of mice fibroblasts L929 cultured with Ca2+-Alg-Cu

      Viability/%E.coliL929 Fibroblast
      Ca2+-Alg108 ± 4100 ± 2
      Ca2+-Alg-Cu1018 ± 196 ± 4
      Ca2+-Alg-Cu207 ± 180 ± 3
      Ca2+-Alg-Cu501 ± 139 ± 8
      t=24 h

      表 2  与Ca2+-Alg-Cu共培养的大肠杆菌存活率与小鼠成纤维L929细胞存活率

      Table 2.  Viabilities of E.coli and mice fibroblasts L929 after incubation with Ca2+-Alg-Cu

      众所周知,纳米材料的体外生物相容性具有时间和剂量依赖性,而我们的实验验证了纳米铜在电泳沉积膜中的含量增加会导致细胞存活率下降,即具有剂量依赖性。同时,值得注意的是,小鼠细胞相比人细胞对纳米铜的敏感度可能更高,而且纳米铜作用下的细胞存活率根据材料与细胞共培养的时间不同可能会有不同的结果。共培养24 h时的细胞存活率,说明Ca2+-Alg-Cu10和Ca2+-Alg-Cu20具备优良的细胞相容性,而Ca2+-Alg-Cu50的细胞相容性可能需要做更长期的体外实验来研究,因此Ca2+-Alg-Cu的体外生物毒性需要进一步研究确认。

    • (1)采用电泳沉积技术制备了Ca2+-Alg-Cu,纳米铜成功引入海藻酸钙电沉积膜中。

      (2)Ca2+-Alg-Cu的颜色随电解液中纳米铜的含量增加而加深。

      (3)Ca2+-Alg-Cu具有对抗大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的广谱抗菌活性,能够通过破坏细菌菌膜,诱导细菌死亡。

      (4)Ca2+-Alg-Cu对细胞存活率的影响主要依赖于其中纳米铜的含量。Ca2+-Alg-Cu10和Ca2+-Alg-Cu20具有优良的细胞相容性,能实现优良抗菌性和体外生物相容性的平衡。

参考文献 (29)

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