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溶液喷纺法制备聚乳酸/锂藻土复合纳米纤维膜及其性能

秋晓锋 罗炜 屈雪 李玉林 刘昌胜

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溶液喷纺法制备聚乳酸/锂藻土复合纳米纤维膜及其性能

    作者简介: 秋晓锋(1993-),男,浙江嘉兴人,工程硕士,主要研究方向为聚乳酸的合成及其生物医学应用。E-mail:qxf_working@163.com.
    通讯作者: 李玉林, yulinli@ecust.edu.cn ; 刘昌胜, liucs@ecust.edu.cn
  • 中图分类号: R318.08

Fabrication and Properties of PLLA/Laponite Composite Nanofiber Membranes via Airbrushing

    Corresponding author: LI Yulin, yulinli@ecust.edu.cn ;LIU Changsheng, liucs@ecust.edu.cn
  • CLC number: R318.08

  • 摘要: 为改善聚左旋乳酸(PLLA)的亲水性和生物活性,采用溶液喷纺法将具有良好亲水性和生物活性的锂藻土(LAP)复合到PLLA纳米纺丝膜中。采用扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、万能试验机、接触角测量仪对纤维膜的形貌、化学结构、力学性能和亲水性进行了表征,并研究了纤维膜的降解性能和细胞相容性。结果表明,适量LAP可在PLLA纳米纤维中均匀分布,所得PLLA/LAP杂化纳米纤维直径为200~300 nm。LAP的引入有助于改进PLLA的亲水性,并提高其力学性能,同时可在一定程度上调节PLLA的降解速率。体外生物学评估表明,LAP的引入能提高纳米纺丝膜的细胞增殖效应。
  • 图 1  溶液喷纺法制备功能性PLLA/LAP复合纳米纤维膜示意图

    Figure 1.  Schematic presentation of preparation of functionalized PLLA/LAP composite nanofiber membranes via airbrushing

    图 2  聚乳酸的核磁共振氢谱图

    Figure 2.  1H-NMR spectrum of PLLA

    图 3  含2% LAP掺杂的复合纳米纤维的EDS分析的SEM照片

    Figure 3.  SEM micrographs and EDS analysis of composite nanofibers containing 2% LAP

    图 4  溶液喷纺装置示意图(a)和3% LAP掺杂的纳米纤维膜外观照片(b)

    Figure 4.  Illustration of airbrushing device (a) and the photograph of nanofiber membrane containing 3% LAP (b)

    图 5  纳米纤维膜的SEM形貌(a~d)和纤维平均直径(e)

    Figure 5.  SEM micrographs (a–d) and mean diameters (e) of nanofiber membranes

    图 6  样品的红外光谱图

    Figure 6.  FT-IR spectra of samples

    图 7  样品的XRD曲线

    Figure 7.  XRD curves of samples

    图 8  PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜的水接触角

    Figure 8.  Water contact angles of PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes

    图 9  PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜的力学性能

    Figure 9.  Mechanical properties of PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes

    图 10  PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜的降解性能

    Figure 10.  Degradation properties of PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes

    图 11  C2C12细胞在PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜表面培养3 d后的细胞存活率

    Figure 11.  Cell viability of C2C12 cultured on PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes for 3 d

    表 1  纳米纤维膜的厚度与溶液黏度

    Table 1.  Thickness of nanofiber membrane and solution viscosity

    Sample Thickness/μm Viscosity/(mPa·s)
    PLLA 152 ± 5 34.3 ± 0.3
    1% LAP 211 ± 16 35.7 ± 0.2
    2% LAP 207 ± 20 42.4 ± 0.2
    3% LAP 122 ± 4 33.3 ± 0.5
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-10-15
  • 网络出版日期:  2019-03-15
  • 刊出日期:  2019-08-01

溶液喷纺法制备聚乳酸/锂藻土复合纳米纤维膜及其性能

    通讯作者: 李玉林, yulinli@ecust.edu.cn
    通讯作者: 刘昌胜, liucs@ecust.edu.cn
    作者简介: 秋晓锋(1993-),男,浙江嘉兴人,工程硕士,主要研究方向为聚乳酸的合成及其生物医学应用。E-mail:qxf_working@163.com
  • 华东理工大学材料科学与工程学院,教育部医用生物材料工程研究中心,上海 200237

摘要: 为改善聚左旋乳酸(PLLA)的亲水性和生物活性,采用溶液喷纺法将具有良好亲水性和生物活性的锂藻土(LAP)复合到PLLA纳米纺丝膜中。采用扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、万能试验机、接触角测量仪对纤维膜的形貌、化学结构、力学性能和亲水性进行了表征,并研究了纤维膜的降解性能和细胞相容性。结果表明,适量LAP可在PLLA纳米纤维中均匀分布,所得PLLA/LAP杂化纳米纤维直径为200~300 nm。LAP的引入有助于改进PLLA的亲水性,并提高其力学性能,同时可在一定程度上调节PLLA的降解速率。体外生物学评估表明,LAP的引入能提高纳米纺丝膜的细胞增殖效应。

English Abstract

  • 由于创伤、意外事故及人口老龄化等原因造成的组织损伤严重威胁人类健康,因此组织修复材料市场需求巨大[1-2]。组织修复一般需要植入人工骨来替代或修复受损组织,因此组织工程支架作为新型骨修复材料获得了广泛的关注[3]。近年来纳米材料的发展促进了其作为生物材料的研究,其中纳米纤维支架因可以模拟天然细胞质基质(ECM)外胶原组成的3D网络结构,可促进细胞增殖与分化,因而作为组织修复支架被广泛应用[4]

    聚乳酸(PLA)是一种具有良好生物相容性和生物降解性的合成高分子。与天然大分子相比,PLA具有可控的结构和生物安全性,因此获得了广泛的应用和关注,如PLA基的膜片材料已被FDA批准,并在临床中运用于体内预防骨科肌腱[5]及腹盆腔手术[6],以防止术后组织黏连。然而,PLA存在亲水性差和生物惰性等缺点,不利于细胞的早期黏附、增殖[7-8],大大限制了其在组织修复方面的应用。与有机高分子相比,无机纳米材料如石墨烯[9]、羟基磷灰石[10]、硅酸盐纳米粒子[11]等既能促进细胞的黏附和铺展,又对细胞的增殖和分化有一定的调控能力,可赋予前者一定的生物功能性。如锂藻土(LAP)作为一种合成的纳米硅酸盐材料,具有特殊的纳米盘结构(厚度约为0.92 nm,直径约为25 nm)和较高的比表面积[11-12],但LAP纳米粒子的胶体稳定性差,因而极大地限制了其在药物控释方面的应用[13]。LAP的化学式为Na+0.7[(Mg5.5Li0.3)Si8O20(OH)4]–0.7,其生物相容性好,可生物降解并能释放出Mg2+、Li+等可促进成骨分化作用的活性成分[14-15]

    纳米纤维制备的方法有许多种,其中静电纺丝是目前制备纳米/微米纤维最常用的技术之一,但静电纺丝具有成本高、效率低、不利于规模化生产等问题,极大地限制了其在生物医学领域的应用。与静电纺丝相比,溶液喷纺法是一种快速、高效制备纳米纤维的纺丝技术,该技术所需设备结构简单、成本较低,可灵活设计。鉴于此,本文首先合成了左旋聚乳酸(PLLA),并利用溶液喷纺技术,将LAP纳米粒子原位掺杂到PLLA纳米纤维中,制备了PLLA/LAP复合纳米纤维。研究表明LAP的引入可改善纺丝膜的亲水性并能加快其降解,同时PLLA/LAP复合纳米纤维可促进小鼠成肌细胞的生长。

    • 无水乙醇、二氯甲烷等普通试剂:分析纯,上海泰坦科技股份有限公司;辛酸亚锡:分析纯,Sigma-Aldrich公司;左旋丙交酯(L-Lactide):分析纯,济南岱罡生物工程有限公司;锂藻土(LAP):分析纯,英国Rocwood Additives公司;喷笔:型号为HD-130,口径为0.5 mm,台湾红叶工具有限公司。

    • 采用丙交酯开环聚合法合成PLLA:在三口烧瓶中依次加入左旋丙交酯和辛酸亚锡(两者质量比为1 000∶1.15),70 ℃减压抽真空2 h,之后快速升温到140 ℃反应6 h。产物经二氯甲烷和无水乙醇溶解沉淀2~3次后提纯处理,60 ℃下真空干燥后得到PLLA样品,将产物PLLA用铝箔热封后放置于−20 ℃冰箱中保存待用。

    • 图1为PLLA/LAP复合纳米纤维膜的制备流程示意图,制备过程如下:将一定量的LAP和PLLA加入体积比为95∶5的二氯甲烷-无水乙醇混合溶剂中,充分搅拌混合(确保PLLA质量浓度为40 mg/mL,LAP分别为PLLA质量的1%、2%、3%)后将混合溶液加入到喷纺笔中通过喷纺法制备纳米纤维膜。喷纺工艺参数为:气压0.2 MPa(压缩氩气)、接收距离20 cm,接收器为直径20 cm的圆盘。纤维膜在室温和通风条件下进行制备,所制备的纤维膜置于60 ℃真空干燥箱中干燥24 h,分别命名为1% LAP、2% LAP和3% LAP。纺丝液黏度采用NDJ-79B型旋转黏度计测试,测试温度为20 ℃,转速为750 r/min,待读数稳定后记录数据。

      图  1  溶液喷纺法制备功能性PLLA/LAP复合纳米纤维膜示意图

      Figure 1.  Schematic presentation of preparation of functionalized PLLA/LAP composite nanofiber membranes via airbrushing

    • 将聚合物配成以氘代氯仿(CD3Cl)为溶剂的溶液,并以四甲基硅烷(TMS)为内标物,采用德国BRUKER公司AVANCE III 500型核磁共振仪测试样品的核磁共振氢谱(1H-NMR);使用英国PL公司GPC50型凝胶渗透色谱(GPC)仪测试PLLA的分子量以及分子量分布情况,流动相为四氢呋喃(THF),流速为1 mL/min,测试温度为35 ℃,标准样为单分散的聚苯乙烯(PS);将干燥后的纤维膜剪下一小块,贴在含有导电胶的扫描电镜(SEM)台上,喷金120 s后,在15 kV的加速电压下,使用日本日立公司S-3400N型电镜观察形貌,并从数张SEM图片中随机挑选50根纤维,使用统计软件Image J量取尺寸,计算平均值;采用日本日立公司S-4800N型电镜配合能谱仪(EDS)分析2% LAP样品的元素组成,检测元素为Mg和Si,并拍摄元素分布图;采用美国赛默飞世尔公司Nicolet 6700型傅里叶红外光谱仪分析样品的组成,每个样品50~80 mg,纤维膜样品和LAP粉末分别采用热涂法和KBr压片法制样,波长测试范围为4 000~500 cm–1;采用日本理学电机公司D/max2550VB型XRD衍射仪测试样品的晶态和结构,测试角度为3°~50°,扫描速率为3(°)/min,扫描步长为0.02°。

    • 将样品裁剪成表面平整的小块膜,3个平行样,控制水滴尽量一样大,待水滴稳定15 s后拍摄照片,并测出接触角大小。

    • 使用美国MTS工业公司CMT-2503型万能试验机测试纤维膜的拉伸性能。将样品膜裁成50 mm × 10 mm的长方形,3个平行样,用测厚仪测薄膜3个不同部位取平均值作为厚度。工艺参数为:常温,力学传感器选择20 N,测试夹距为25 mm,拉伸速率为3 mm/min。

    • 将降解样品裁剪成相同大小的圆形膜,精确记录其初始质量(m0,每个样品质量20 mg左右),设置3个平行样。将样品加入含有10 mL pH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)的降解瓶中,在37 ℃恒温振荡箱中研究纤维膜的降解情况。每隔14 d将样品取出低温烘干称重(mi),计算相对质量(mi/m0)变化,并测PBS的pH。将样品在固定的降解时间点取出烘干并利用SEM观察降解样品表面形貌变化。

    • 将样品膜裁成相同大小的形状,3个平行样,置于24孔板内,外加1个空白组,辐射灭菌处理。将细胞培养基加入24孔板中,每孔接3×104个C2C12细胞,并将孔板置于37 ℃细胞培养箱内孵育。到时间点后,每孔中加入400 μL、5 mg/mL的MTT液,继续培养4 h。到时间点后吸去孔板里的培养基,每孔加入500 μL二甲基亚砜溶液,振荡15 min使紫色结晶物完全溶解。结晶物溶解后每孔取100 μL放置于酶标仪上,在492 nm波长处检测吸光度值。样品与空白样品的吸光度比值即为细胞活性。

    • 采用Origin 8.5数据分析软件对实验数据进行统计学分析,结果以“平均值±标准差(M ± SD)”表示。

    • 图2是PLLA的核磁共振氢谱图,由图2可知,1.56处是高分子链上CH3的化学位移,而5.16处为高分子骨架上C―H的化学位移[16]。这些结果表明PLLA已经顺利合成。

      图  2  聚乳酸的核磁共振氢谱图

      Figure 2.  1H-NMR spectrum of PLLA

      由GPC结果分析可知,本方法合成的PLLA,其数均分子量为3.59×105,重均分子量为5.25×105,且多分散指数较小(PDI=1.46),表明其分子量分布窄。

    • 因LAP具有Na、Mg、Si等元素,而PLLA主要为C、O元素,所以采用EDS测试可定性阐明LAP在PLLA纳米纤维膜中的分布情况。样品2% LAP的EDS结果如图3所示。由图3可知,Mg和Si元素在样品中分布较为均一。该结果证明了LAP较为均匀地分布在PLLA纳米纤维中。

      图  3  含2% LAP掺杂的复合纳米纤维的EDS分析的SEM照片

      Figure 3.  SEM micrographs and EDS analysis of composite nanofibers containing 2% LAP

    • 图4(a)为溶液喷纺所需的商用Airbrush喷笔,其上方为溶液杯,下方为压缩气体入口,尾部为气体流量调节器。图4(b)为喷纺法原位沉积得到的3% LAP复合纳米纤维膜的表观照片。制备4种样品时控制PLLA用量都为1 g,并将它们均原位沉积在直径20 cm的接收器上。纤维膜的厚度如表1所示,可观察到4种样品的厚度均在120~220 μm,且同一样品的厚度比较均匀,表明溶液喷纺制备纳米纤维膜的工艺比较稳定。从表1可以看出,随着LAP用量的增加,纺丝溶液的黏度先升高后降低,表明适量的LAP会增加溶液黏度,而过多的用量可能会使纳米粒子沉降、团聚,从而引起溶液局部黏度的降低。

      Sample Thickness/μm Viscosity/(mPa·s)
      PLLA 152 ± 5 34.3 ± 0.3
      1% LAP 211 ± 16 35.7 ± 0.2
      2% LAP 207 ± 20 42.4 ± 0.2
      3% LAP 122 ± 4 33.3 ± 0.5

      表 1  纳米纤维膜的厚度与溶液黏度

      Table 1.  Thickness of nanofiber membrane and solution viscosity

      图  4  溶液喷纺装置示意图(a)和3% LAP掺杂的纳米纤维膜外观照片(b)

      Figure 4.  Illustration of airbrushing device (a) and the photograph of nanofiber membrane containing 3% LAP (b)

      纯PLLA和PLLA/LAP纤维的纺丝速率(以材料质量(mg)与纺丝时间(min)的比值为衡量标准),可达25~35 mg/min,是静电纺丝的10~20倍[17-18],可见该技术具有非常高的纤维制备效率。图5为PLLA及PLLA/LAP纤维膜的SEM形貌及平均直径。从形貌上来看,纤维交错成网状结构,具有独特的取向结构,所形成的孔径为1~10 μm。纤维样品的直径为100~400 nm,表明形成了直径分布较窄且直径较小的纤维丝,这是由于压缩气体给予溶液的拉伸力与溶液表面张力相平衡,使喷纺过程中溶液的流动十分均匀和顺畅而导致的结果。其中PLLA纳米纤维的直径为(268 ± 83)nm,当LAP相对于PLLA的质量分别为1%、2%、3%时,相应的复合纤维的直径分别为(242 ± 60)、(207 ± 46)nm和(237 ± 66)nm。随着LAP的掺入量增加,纤维直径呈现先降低后增加的趋势,这是因为LAP是一种无机纳米粒子,适量的LAP可使纺丝液的黏度升高,从而降低了复合纤维的直径;但过多的含量(大于3%)极易使LAP纳米粒子沉降、团聚和喷嘴堵塞,造成局部黏度降低(黏度数据见表1),进而导致纤维直径的增加。除此之外,不难看出溶液喷纺技术可以制备直径很小的纤维(100~300 nm)。

      图  5  纳米纤维膜的SEM形貌(a~d)和纤维平均直径(e)

      Figure 5.  SEM micrographs (a–d) and mean diameters (e) of nanofiber membranes

    • 图6为样品的红外光谱曲线。其中PLLA位于1 757 cm−1处的特征吸收峰来自于C=O的伸缩振动,而1 092 cm−1处的吸收峰则来自于C―O的伸缩振动[19],表明PLLA的成功合成。由于LAP是无机硅酸盐类材料,位于3 454 cm−1和1 009 cm−1处的特征吸收峰则来自硅酸盐中大量的Si―OH基团[20];但是在复合纳米纤维膜的红外光谱中并未出现LAP的相关特征吸收峰,可能原因是LAP纳米粒子在纺丝过程中完全包埋入PLLA纳米纤维中。

      图  6  样品的红外光谱图

      Figure 6.  FT-IR spectra of samples

    • 样品的XRD曲线如图7所示。16.52°处为PLLA纳米纤维的特征结晶峰,说明PLLA是结晶型聚合物[21]。19.7°处是LAP粒子特有的衍射峰[22]。1% LAP、2% LAP和3% LAP复合纤维膜在16.5°和18.65°处表现出比PLLA更尖锐的衍射峰,说明LAP纳米粒子可以极大地提高PLLA纳米纤维的结晶性,其中3% LAP展现出相对最强的结晶性,这是因为PLLA的结晶性受成核作用影响,LAP纳米粒子可降低成核活化能从而促进PLLA的结晶行为。

      图  7  样品的XRD曲线

      Figure 7.  XRD curves of samples

    • 纯PLLA、1% LAP、2% LAP和3% LAP纤维膜的水接触角如图8所示,分别为(122.0 ± 2.8)°、(108.3 ± 5.3)°、(105.8 ± 0.4)°和(102.9 ± 7.3)°,可以看到,随着LAP用量的提高,接触角呈现下降的趋势,其中3% LAP的亲水性最佳,其接触角比纯PLLA降低约20°。这是因为LAP是一种亲水性的纳米材料,通过LAP和PLLA共混可使LAP分布在PLLA中,使复合纤维膜的亲水性得到改善。接触角的结果直观地证明了LAP粒子均匀地分布在PLLA基体中。

      图  8  PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜的水接触角

      Figure 8.  Water contact angles of PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes

    • 图9为纯PLLA纤维膜和PLLA/LAP复合纤维膜的拉伸力学性能图。由于溶液喷纺法是通过“喷洒”聚合物溶液的方式来制备纳米纤维的,因此该法制备得到的是随机排列的短纤维,导致纤维膜结构较松散,因此其力学强度较小。其中,3% LAP复合纤维膜的拉伸强度是PLLA纤维膜的2.5倍,表明适量的LAP有助于提高复合纤维膜的拉伸强度(图9(a))。由图9(b)可知,纯PLLA纤维膜的杨氏模量为(2.56 ± 0.54)MPa;随着LAP用量的增加,复合纤维膜的杨氏模量呈现逐渐上升的趋势,3% LAP复合纤维膜的杨氏模量达到了(9.20 ± 0.65)MPa。这些结果说明少量LAP的存在使复合纤维膜具有比纯PLLA更加优异的力学性能,其中3% LAP复合纤维膜具有最佳的强度和韧性。

      图  9  PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜的力学性能

      Figure 9.  Mechanical properties of PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes

    • 降解局部酸碱性、降解周期和降解过程中力学性能等变化是显示材料生物可降解性能的一系列因素[23]。PLA降解的机理主要是其分子链中的酯键吸水后断裂造成分子量逐步降低,降解成二氧化碳和水[24]

      图10为PLLA和PLLA/LAP纤维膜降解前后的质量变化、PBS降解液的pH变化和SEM形貌。从质量损失图(图10(a))上来看,前期的膜质量增加可能是因为材料吸水造成的,且PLLA/LAP复合膜的吸水率更高,这是由亲水性LAP纳米粒子的存在导致的。图10(a)显示在112 d的降解点,样品的质量均没有损失,这可能有两个主要原因:(1)材料的数均分子量大(Mn=3.5×105)造成降解过慢;(2)材料上残留的二氯甲烷包裹在纤维表面,使材料和降解液的表界面交互作用减弱;而pH在降解112 d后有一定降低,说明材料有少量的降解,且LAP的加入对纤维膜在降解过程中质量和pH的变化影响较小(图10(b))。通过SEM进一步地观察了降解前后材料表面形貌(图10(c)),当降解时间为56 d时,PLLA纤维膜未出现明显形貌变化,而PLLA/LAP纤维膜则出现了一定的降解,主要表现为纤维出现缠绕、弯曲和团聚现象(图10(c)红色箭头处)。降解112 d后,各组分的纳米纤维均出现了明显变粗或者破裂的情况,且3% LAP纤维膜最为明显,这可能是由于PLLA/LAP纤维膜长期浸泡在降解液中导致聚合物与纳米粒子表界面产生裂缝,加快了水分的渗入。以上结果说明LAP的引入可加快PLLA的降解。

      图  10  PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜的降解性能

      Figure 10.  Degradation properties of PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes

    • 生物材料良好的生物相容性是其生物医学应用的前提,就组织工程支架材料而言,影响细胞活性的因素主要有支架的孔隙率、孔径和亲疏水性[3, 25]。本文以小鼠成肌细胞C2C12为模型,采用MTT法评估了第3 d时纤维支架的细胞毒性,以空白组为对照组,结果如图11所示。据文献[26]报道,细胞在材料表面首先进行黏附行为,待黏附后进行增殖行为,而材料相对疏水则不利于细胞黏附和增殖。第3 d时材料组细胞相对活性均高于空白组,这表明溶液喷纺法制备的PLLA和PLLA/LAP纳米纤维具有促进细胞增殖的作用,并且PLLA的细胞活性达到了115%,而2% LAP和3% LAP的细胞活力达到了120%左右,表明LAP纳米粒子有良好的生物相容性,且可促进C2C12细胞的增殖。

      图  11  C2C12细胞在PLLA、PLLA/LAP纳米纤维膜表面培养3 d后的细胞存活率

      Figure 11.  Cell viability of C2C12 cultured on PLLA and PLLA/LAP nanofiber membranes for 3 d

    • (1)通过溶液喷纺技术高效、快速地制备了PLLA/LAP复合纳米纤维膜。

      (2)LAP的引入可加快PLLA/LAP复合纤维膜的降解,当LAP掺入量是PLLA质量的3%时,降解效果最为明显。

      (3)LAP复合进PLLA中提高了复合纤维膜的亲水性,其中当LAP掺入量是PLLA质量的3%时,复合纤维膜的接触角比纯PLLA纤维膜降低约20°。

      (4)LAP掺杂改性提高了细胞在纳米纤维膜表面的增殖能力。

参考文献 (26)

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